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用途：本試劑(ji)盒僅供科(ke)研使用，定量檢測細胞液、體液、組織、血清(qing)、血漿(jiang)等(deng)標本中大(da)鼠溶血磷脂酰(xian)膽堿(LPC)的含量。

原理：

采用雙抗體夾(jia)心法測(ce)定MTHFD2水平。用純化的MTHFD2抗(kang)體(ti)包被微孔板，制成(cheng)固(gu)相載

體，實驗(yan)時(shi)依(yi)次在微孔板中加入(ru)樣(yang)本及標(biao)準品(pin)，并加入(ru) HRP 標(biao)記(ji)的(de) ABP 抗(kang)體，形成抗(kang)體-抗(kang)原-酶標(biao)抗(kang)體復合物(wu)，反復洗滌后加底(di)物(wu) TMB 顯(xian)色(se)。TMB 在過氧(yang)化物(wu)酶的(de)催化下(xia)轉化為藍色(se)，再(zai)用硫酸終止(zhi)反應，轉變(bian)成黃(huang)色(se)。顏色(se)的(de)深淺和樣(yang)品(pin)中的(de) ABP含(han)量呈正相(xiang)關。采用酶標(biao)儀在 450nm 波長測定吸光度（OD 值），根據(ju)標(biao)準曲(qu)線，計算測試(shi)樣(yang)品(pin)中 ABP 濃度。

試劑盒(he)組成：

實驗材(cai)料與試劑配(pei)制：

1. 儀器與(yu)材料：酶標儀（使(shi)用前預(yu)熱30分鐘），微量加液器、吸頭、蒸(zheng)餾水或去離子水，濾紙。

2. 緩(huan)(huan)沖液(ye)使用：加5ul 的(de)緩(huan)(huan)沖液(ye)于50ul 的(de)樣品(pin)(pin)中，如果樣品(pin)(pin)量(liang)不夠或者不確定，緩(huan)(huan)沖液(ye)和(he)樣品(pin)(pin)的(de)混合比例(li)不要小于1:10即可。

混(hun)勻，靜(jing)置1小時備用（如果標本是血(xue)清或者血(xue)漿，此(ci)步(bu)驟(zou)忽略）。

3. 洗液(ye)的配(pei)制：按(an)1:100的比例配(pei)制洗液(ye)備用(yong)。

樣(yang)品收(shou)集、處理及保存：

1. 細(xi)胞培養上清：適用于檢測體外培養的細(xi)胞分(fen)泌性成(cheng)份(fen)。用無菌(jun)管收(shou)集(ji)細(xi)胞上清液，以1000×g離(li)心15分(fen)鐘，收(shou)集(ji)上清。

2. 細(xi)胞(bao)：用PBS反復洗滌細(xi)胞(bao)3次，調整細(xi)胞(bao)濃度達到104

-106/ml 左右，通過反復凍融，使細胞(bao)破壞并(bing)放出細胞(bao)內成份，或

者細胞超聲(sheng)粉碎(sui)，離心取上清液檢測(ce)。

3. 血清：在室溫下(xia)，血液自然凝固，以1000×g離心15分鐘(zhong)，取上清待(dai)測。

4. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA 或檸(ning)檬酸鈉作為抗凝劑，混合(he)后靜置10-20 分鐘后，以1000×g離(li)心15分鐘，收集上清(qing)。

5. 體液：包括胸腹水(shui)、腦脊液，分泌物等。使用(yong)不含熱原(yuan)和(he)內毒素的離心管收集(ji)，以1000×g離心15分鐘，收集(ji)上清。

6. 組(zu)織(zhi)標本：切取組(zu)織(zhi)標本，稱取重量(liang)0.5mg，加(jia)入(ru)500ul 的(de)PBS，用手工或勻(yun)漿器，或超聲破(po)碎儀將標本勻(yun)漿，以2000-3000

rmp離心(xin)20 分(fen)鐘，收(shou)集上清(qing)進行檢(jian)測。

7. 樣品中不能(neng)含有(you)NaN3，因NaN3 抑制辣根過氧(yang)化(hua)物酶的（HRP）活性。

8. 保存：如果(guo)樣品不能立即檢測，應將其分裝，-70 ℃保存，避免(mian)反(fan)復(fu)冷凍。保存過(guo)程(cheng)中如出現沉淀，應再次離(li)心。血液標

本盡可(ke)能的(de)不要使用溶血(xue)或高血(xue)脂血(xue)。如果血(xue)清中含大量顆(ke)粒，檢測(ce)前(qian)先(xian)離(li)心或過濾。不要在(zai)37℃或更高的(de)溫度加熱解

凍(dong)。應(ying)在(zai)室溫(wen)下(xia)解凍(dong)并(bing)確保樣(yang)品均勻地充分解凍(dong)。

操作步(bu)驟：

1. 取(qu)出(chu)試劑盒，室溫(wen)（20-25℃）放置 30 分鐘(zhong)。

2. 分組：取(qu)出(chu) 96 孔(kong)板，根據待測(ce)樣(yang)品數(shu)量(liang)加上標準品的(de)數(shu)量(liang)決定所需(xu)的(de)板條數(shu)，把(ba)剩余(yu)的(de)板條繼續冷(leng)藏處(chu)理。分別設(she)標準

品組(zu)（6 個濃度）、空白孔(kong)、待測樣品組(zu)。

注：為減(jian)少實驗誤差，保證(zheng)準確性，建議(yi)設置復(fu)孔。

3. 加樣：依照(zhao)標(biao)準品的(de)順序(xu)分別(bie)加入(ru) 50ul 的(de)標(biao)準品溶液于空(kong)(kong)白微孔(kong)中；空(kong)(kong)白對照(zhao)孔(kong)加入(ru) 50ul 的(de)蒸餾水(shui)；其(qi)余微孔(kong)中加入(ru) 50ul

的(de)待測樣(yang)本。

4. 加酶標(biao)溶液(ye)：標(biao)準(zhun)品組、待測樣(yang)本(ben)組各孔(kong)中加入 100ul 的酶標(biao)溶液(ye)（空白(bai)對照孔(kong)除外(wai)）。

5. 溫(wen)育(yu)：酶標板用封板紙密封后，放入濕盒內(nei)于(yu) 37℃恒溫(wen)孵(fu)育(yu) 1 小時。

6. 洗(xi)板(ban)(ban)：用(yong)稀釋后的洗(xi)滌液注滿每孔，靜(jing)置 15-30s，充(chong)分清洗(xi)酶標板(ban)(ban) 5 次，用(yong)吸水紙徹底(di)拍干。

7. 顯色(se)：各孔加入(ru)顯色(se)劑(ji) A 液(ye) 50ul 后，再加入(ru)顯色(se)劑(ji) B 液(ye) 50ul。

8. 終(zhong)止：25-37℃下避光反應(ying) 10-15 分鐘，加入(ru) 50ul 終(zhong)止液。

9. 讀板：在 450nm 波長讀取各孔的 OD 值(zhi)。

注(zhu)意事(shi)項：

1. 實驗操作(zuo)中必須使用一次(ci)性吸頭，避免交叉污(wu)染。

2. 加樣：加樣時，要控制加樣速度，避免**孔(kong)與最后一(yi)孔(kong)間(jian)(jian)的時間(jian)(jian)間(jian)(jian)隔過(guo)大，否則將會導致不同的預(yu)孵育時間(jian)(jian)，從而影響

實驗的準確性以及重復性。

3. 孵育(yu)：嚴格按照說明書(shu)上規(gui)定的(de)孵育(yu)時間和溫度進行(xing)。

4. 反(fan)應(ying)時間的控制：加(jia)入(ru)底物(wu)后(hou)請(qing)定時觀察反(fan)應(ying)孔的顏色變化，如(ru)果(guo)顏色較深，請(qing)提前加(jia)入(ru)終止(zhi)液終止(zhi)反(fan)應(ying)。

5. 建議實(shi)驗前預測(ce)樣(yang)品含量，如樣(yang)品濃度過高，應對樣(yang)品進行稀釋，計算結果時(shi)乘以相應的稀釋倍數。

6. 建議(yi)使用(yong)本試(shi)劑盒(he)時先做(zuo)(zuo)預實驗（即先做(zuo)(zuo)標準曲線，試(shi)用(yong)幾(ji)個標本），如果對本試(shi)劑盒(he)有任(ren)何疑問(wen)，可和所購經銷商聯系，

如果因(yin)運(yun)輸(shu)過程(cheng)導致試劑(ji)盒(he)失(shi)效(xiao)，可(ke)要求調換，但概不承擔產品本(ben)身以外的任何損失(shi)。

性能

1. 靈敏度(du)(du)：最小的檢測濃(nong)(nong)度(du)(du)小于1號標準品(pin)。稀釋度(du)(du)的線性。樣品(pin)線性回歸與預期濃(nong)(nong)度(du)(du)相關(guan)系數(shu)R值為0.990。

2. 特(te)異性：不與其它細胞因子(zi)反應。

3. 重(zhong)復性：板內(nei)、板間變(bian)異系數均小于10%。

結果判斷與(yu)分析

1、儀器值(zhi)：于波長450nm的酶(mei)標儀上讀取各孔的OD值(zhi)

2、以吸(xi)光度(du)OD值為(wei)縱(zong)坐標(biao)（Y），相應(ying)的待(dai)測物(wu)質標(biao)準品濃度(du)為(wei)橫坐標(biao)（X），做得(de)相應(ying)的曲線(xian)，樣(yang)品的待(dai)測物(wu)質含量可(ke)根(gen)據(ju)其OD值由(you)標(biao)準曲線(xian)換算出(chu)相應(ying)的濃度(du)。