豬β-防御素114(PBD114)酶(mei)聯免疫(yi)分析(xi)用途：
本(ben)試劑盒僅(jin)供科研(yan)使用，定量檢測細(xi)胞液(ye)、體(ti)液(ye)、組織、血(xue)清、血(xue)漿等標本(ben)中mammary carcinoma Marker-CA153的含量。
原(yuan)理：
采(cai)用(yong)雙抗體夾心法測定mammary carcinoma Marker-CA153水平。用(yong)純化的(de)mammary carcinoma Marker-CA153抗體包被微(wei)孔板，制成固相(xiang)載
體(ti)，實驗時依(yi)次在(zai)(zai)微孔板中加入樣(yang)本及標準品(pin)，并加入 HRP 標記(ji)的(de) ABP 抗(kang)體(ti)，形成抗(kang)體(ti)-抗(kang)原-酶標抗(kang)體(ti)復合物(wu)，反(fan)復洗滌后(hou)加底(di)物(wu) TMB 顯色(se)。TMB 在(zai)(zai)過氧化物(wu)酶的(de)催化下轉化為(wei)藍色(se)，再用(yong)硫酸終止(zhi)反(fan)應，轉變成黃色(se)。顏(yan)色(se)的(de)深淺和樣(yang)品(pin)中的(de) ABP含(han)量(liang)呈正相關。采用(yong)酶標儀在(zai)(zai) 450nm 波長(chang)測(ce)定吸光(guang)度（OD 值），根(gen)據(ju)標準曲線，計算測(ce)試樣(yang)品(pin)中 ABP 濃度。
豬β-防御素114(PBD114)酶(mei)聯免疫分析試劑盒組成：
1 | 30 倍濃(nong)縮洗滌(di)液 | 20ml×1 瓶 | 7 | 終(zhong)止液(ye) | 6ml×1 瓶 |
2 | 酶標試劑 | 6ml×1瓶 | 8 | 陽性對照 | 0.5ml×1 瓶 |
3 | 酶標包被板 | 12 孔(kong)×8 條 | 9 | 陰(yin)性(xing)對照(zhao) | 0.5ml×1 瓶(ping) |
4 | 樣(yang)品稀釋液 | 6ml×1 瓶 | 10 | 說明書 | 1 份(fen) |
5 | 顯色劑 A 液 | 6ml×1 瓶 | 11 | 封板膜 | 2 張 |
6 | 顯色劑 B 液 | 6ml×1/瓶 | 12 | 密封袋 | 1 個 |
豬β-防御素114(PBD114)酶聯免疫分析(xi)實(shi)驗材料與試劑(ji)配(pei)制(zhi)：
1. 儀器與材料：酶標(biao)儀（使用前預熱30分鐘），微量加液(ye)器、吸頭、蒸餾水或(huo)去離子水，濾紙。
2. 緩(huan)沖(chong)液使用：加5ul 的(de)緩(huan)沖(chong)液于50ul 的(de)樣(yang)品中，如果(guo)樣(yang)品量不(bu)夠或者不(bu)確定(ding)，緩(huan)沖(chong)液和(he)樣(yang)品的(de)混合比(bi)例不(bu)要小于1:10即(ji)可。
混(hun)勻，靜置(zhi)1小時(shi)備用（如果標本(ben)是血(xue)清或者血(xue)漿，此步(bu)驟忽略）。
3. 洗(xi)液(ye)的配(pei)制：按1:100的比(bi)例配(pei)制洗(xi)液(ye)備(bei)用。
樣品(pin)收集(ji)、處理(li)及保存：
1. 細胞培(pei)養上(shang)(shang)清(qing)：適用于檢測體外培(pei)養的細胞分泌性成份。用無菌管收集(ji)細胞上(shang)(shang)清(qing)液，以1000×g離心15分鐘，收集(ji)上(shang)(shang)清(qing)。
2. 細胞：用PBS反復洗滌細胞3次，調(diao)整細胞濃(nong)度達到104
-106
/ml 左右，通過反復(fu)凍融，使細(xi)(xi)胞破壞并放(fang)出細(xi)(xi)胞內成份，或
者細胞超(chao)聲(sheng)粉碎(sui)，離(li)心取上清液(ye)檢測。
3. 血(xue)(xue)清(qing)：在室溫下，血(xue)(xue)液自然凝(ning)固(gu)，以1000×g離心15分鐘，取上清(qing)待測。
4. 血(xue)漿(jiang)：應根(gen)據(ju)標本的要求選擇EDTA 或檸(ning)檬酸鈉作為抗凝劑，混合后靜置(zhi)10-20 分(fen)鐘后，以1000×g離心15分(fen)鐘，收集上
清。
5. 體液：包括胸腹水(shui)、腦脊液，分泌(mi)物等。使用不含(han)熱原和內毒素(su)的(de)離(li)心管收集，以(yi)1000×g離(li)心15分鐘，收集上清。
6. 組織標(biao)本：切(qie)取組織標(biao)本，稱取重量(liang)0.5mg，加入500ul 的(de)PBS，用手工或(huo)勻漿器，或(huo)超聲破(po)碎儀將標(biao)本勻漿，以2000-3000
rmp離心20 分鐘，收集上清進行(xing)檢測。
7. 樣品中不(bu)能含有NaN3，因NaN3 抑(yi)制辣根過氧化物酶(mei)的（HRP）活性。
8. 保(bao)(bao)存(cun)：如(ru)果樣品不(bu)能立即(ji)檢測，應將其分(fen)裝，-70 ℃保(bao)(bao)存(cun)，避免反(fan)復冷(leng)凍。保(bao)(bao)存(cun)過程中如(ru)出現沉淀(dian)，應再次離心。血(xue)液標
本(ben)盡可(ke)能(neng)的(de)不(bu)要(yao)使用溶血(xue)或高血(xue)脂血(xue)。如果血(xue)清中含大量顆粒，檢測前先離(li)心或過濾。不(bu)要(yao)在37℃或更高的(de)溫度加(jia)熱(re)解
凍。應在室溫下解凍并確保樣品(pin)均勻(yun)地充分解凍。
豬β-防御素114(PBD114)酶聯(lian)免疫分析操作步驟(zou)：
1. 取出試(shi)劑盒，室溫（20-25℃）放置 30 分鐘。
2. 分組：取(qu)出 96 孔(kong)板(ban)(ban)(ban)，根(gen)據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板(ban)(ban)(ban)條數，把(ba)剩(sheng)余的板(ban)(ban)(ban)條繼續(xu)冷藏處理。分別設標準
品組(zu)（6 個濃度）、空白孔(kong)、待測樣品組(zu)。
注：為減少實驗誤差，保(bao)證準確性(xing)，建議設置復孔。
3. 加樣：依照標(biao)(biao)準品的順序分別(bie)加入 50ul 的標(biao)(biao)準品溶液于空白微孔中；空白對照孔加入 50ul 的蒸(zheng)餾水；其余微孔中加入 50ul
的待測樣本。
4. 加酶標溶(rong)液：標準品組(zu)、待測樣本組(zu)各孔中加入 100ul 的酶標溶(rong)液（空白對照孔除外）。
5. 溫育(yu)：酶標板用封板紙密封后，放入濕盒內于(yu) 37℃恒溫孵育(yu) 1 小時。
6. 洗(xi)(xi)板(ban)：用稀釋后(hou)的(de)洗(xi)(xi)滌液(ye)注滿每孔，靜(jing)置 15-30s，充分清(qing)洗(xi)(xi)酶(mei)標板(ban) 5 次，用吸水紙徹(che)底拍(pai)干。
7. 顯(xian)色(se)：各(ge)孔加入顯(xian)色(se)劑(ji)(ji) A 液(ye) 50ul 后，再(zai)加入顯(xian)色(se)劑(ji)(ji) B 液(ye) 50ul。
8. 終止：25-37℃下避光(guang)反應 10-15 分鐘，加入 50ul 終止液(ye)。
9. 讀板：在 450nm 波(bo)長讀取各孔的(de) OD 值(zhi)。
豬(zhu)β-防御素114(PBD114)酶聯免疫分析注(zhu)意事項：
1. 實驗操作中必須使用一(yi)次性吸(xi)頭，避免交(jiao)叉污染(ran)。
2. 加(jia)樣(yang)：加(jia)樣(yang)時(shi)，要控制(zhi)加(jia)樣(yang)速度，避免**孔與最(zui)后一孔間的時(shi)間間隔過大，否則將會導(dao)致(zhi)不同的預孵育(yu)時(shi)間，從而影響
實驗的準(zhun)確性以及重復性。
3. 孵(fu)育(yu)：嚴(yan)格按照(zhao)說明書上規定的孵(fu)育(yu)時間(jian)和溫度進行。
4. 反應時間的控制：加入底物后請定(ding)時觀察反應孔的顏色變化，如果(guo)顏色較深，請提前加入終止液終止反應。
5. 建議實驗前預測樣品含量，如樣品濃度過高，應(ying)對樣品進行稀釋，計算結(jie)果時乘以相應(ying)的稀釋倍數(shu)。
6. 建議使用(yong)本(ben)試(shi)劑(ji)盒(he)(he)時先做預實驗(yan)（即先做標(biao)準曲線(xian)，試(shi)用(yong)幾個標(biao)本(ben)），如果對本(ben)試(shi)劑(ji)盒(he)(he)有任何疑問，可和(he)所購經(jing)銷(xiao)商聯系(xi)，
如果因(yin)運輸過程(cheng)導致試劑(ji)盒失效，可(ke)要求(qiu)調換(huan)，但概不承擔產品本身以(yi)外的任何損失。
豬β-防御(yu)素(su)114(PBD114)酶聯免疫分析(xi)性能
1. 靈敏度(du)：最(zui)小(xiao)的檢測濃度(du)小(xiao)于(yu)1號標準品。稀釋度(du)的線(xian)性。樣品線(xian)性回歸與預期濃度(du)相關系數R值為(wei)0.990。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應(ying)。
3. 重復性：板內、板間(jian)變異系數均(jun)小(xiao)于10%。
結果判斷(duan)與分析(xi)
1、儀器值：于(yu)波長450nm的(de)酶標(biao)儀上讀取各(ge)孔(kong)的(de)OD值
2、以吸光度OD值(zhi)為縱坐標(biao)(biao)（Y），相應的(de)(de)待測物質(zhi)標(biao)(biao)準品(pin)濃度為橫(heng)坐標(biao)(biao)（X），做得(de)相應的(de)(de)曲線，樣品(pin)的(de)(de)待測物質(zhi)含量(liang)可根據其OD值(zhi)由標(biao)(biao)準曲線換算出相應的(de)(de)濃度。
