豬β-防(fang)御素129(PBD129)酶聯免疫分析用途(tu)：
本試劑盒僅供科(ke)研使用，定量(liang)檢測細胞液、體液、組織、血清、血漿等標本中mammary carcinoma Marker-CA153的含量(liang)。
原理：
采用雙抗(kang)體夾心(xin)法測(ce)定mammary carcinoma Marker-CA153水(shui)平。用純化的mammary carcinoma Marker-CA153抗(kang)體包被微(wei)孔(kong)板，制成(cheng)固(gu)相(xiang)載(zai)
體，實驗時依(yi)次在(zai)微孔(kong)板中(zhong)加入(ru)樣(yang)本(ben)及(ji)標準品(pin)，并加入(ru) HRP 標記的(de)(de) ABP 抗(kang)(kang)體，形成(cheng)(cheng)抗(kang)(kang)體-抗(kang)(kang)原(yuan)-酶(mei)標抗(kang)(kang)體復(fu)合物，反(fan)復(fu)洗滌后(hou)加底物 TMB 顯色。TMB 在(zai)過氧化物酶(mei)的(de)(de)催化下(xia)轉化為藍色，再用硫酸(suan)終(zhong)止反(fan)應(ying)，轉變成(cheng)(cheng)黃色。顏色的(de)(de)深淺和樣(yang)品(pin)中(zhong)的(de)(de) ABP含(han)量呈正相關(guan)。采用酶(mei)標儀在(zai) 450nm 波長(chang)測定吸(xi)光度(du)（OD 值），根據標準曲線(xian)，計算測試(shi)樣(yang)品(pin)中(zhong) ABP 濃度(du)。
Mouse mammary carcinoma Marker-CA153 Elisa Kit試劑(ji)盒組成(cheng)：
1 | 30 倍(bei)濃縮洗滌液(ye) | 20ml×1 瓶 | 7 | 終止液(ye) | 6ml×1 瓶(ping) |
2 | 酶(mei)標試劑 | 6ml×1瓶 | 8 | 陽性對照 | 0.5ml×1 瓶 |
3 | 酶標包被板 | 12 孔×8 條 | 9 | 陰性對照 | 0.5ml×1 瓶 |
4 | 樣品稀釋液 | 6ml×1 瓶 | 10 | 說明書 | 1 份 |
5 | 顯色劑 A 液 | 6ml×1 瓶 | 11 | 封板膜 | 2 張 |
6 | 顯色劑(ji) B 液 | 6ml×1/瓶(ping) | 12 | 密封袋 | 1 個 |
豬β-防御素129(PBD129)酶聯免疫分析(xi)實驗材料與試(shi)劑配制：
1. 儀器(qi)與材(cai)料：酶標儀（使用(yong)前預熱30分鐘(zhong)），微量加液(ye)器(qi)、吸頭、蒸餾(liu)水或(huo)去離子(zi)水，濾(lv)紙。
2. 緩(huan)(huan)沖液(ye)使用：加5ul 的(de)緩(huan)(huan)沖液(ye)于50ul 的(de)樣品(pin)中，如果樣品(pin)量不夠或者(zhe)不確定，緩(huan)(huan)沖液(ye)和(he)樣品(pin)的(de)混合比(bi)例不要小(xiao)于1:10即(ji)可(ke)。
混勻，靜置1小時備用（如果標本是血清或者血漿，此步驟忽(hu)略）。
3. 洗液的(de)配制(zhi)：按1:100的(de)比例配制(zhi)洗液備用。
樣品(pin)收集、處理(li)及保(bao)存：
1. 細(xi)胞(bao)培養(yang)上清：適用(yong)于檢測體外培養(yang)的細(xi)胞(bao)分(fen)泌性成份。用(yong)無菌(jun)管收(shou)集細(xi)胞(bao)上清液，以1000×g離心15分(fen)鐘，收(shou)集上清。
2. 細胞：用PBS反(fan)復洗滌細胞3次，調整細胞濃度達到104
-106
/ml 左(zuo)右，通過反復(fu)凍融，使細(xi)胞破壞(huai)并放出細(xi)胞內成份，或
者(zhe)細(xi)胞超聲粉碎(sui)，離心取上清液檢測。
3. 血清：在室溫下，血液自然凝固，以(yi)1000×g離心(xin)15分鐘，取上清待測。
4. 血漿：應根據標本的要求選擇(ze)EDTA 或檸檬(meng)酸鈉作為抗凝劑(ji)，混合后(hou)靜置10-20 分(fen)鐘(zhong)后(hou)，以1000×g離(li)心(xin)15分(fen)鐘(zhong)，收集上(shang)
清。
5. 體液(ye)(ye)：包括(kuo)胸(xiong)腹水(shui)、腦脊液(ye)(ye)，分泌物(wu)等。使(shi)用不含(han)熱原和內(nei)毒素(su)的離心管收集(ji)，以(yi)1000×g離心15分鐘，收集(ji)上清。
6. 組織標(biao)本(ben)(ben)：切取組織標(biao)本(ben)(ben)，稱取重量(liang)0.5mg，加入500ul 的PBS，用手(shou)工或(huo)勻(yun)漿(jiang)器(qi)，或(huo)超(chao)聲破碎儀將標(biao)本(ben)(ben)勻(yun)漿(jiang)，以2000-3000
rmp離心20 分鐘，收(shou)集上(shang)清進行檢測。
7. 樣品中不能(neng)含(han)有NaN3，因NaN3 抑制辣根過(guo)氧化物酶的（HRP）活性。
8. 保存(cun)：如果樣(yang)品不能立即檢測，應(ying)將其(qi)分裝，-70 ℃保存(cun)，避免(mian)反復冷(leng)凍。保存(cun)過(guo)程中如出現沉(chen)淀，應(ying)再(zai)次離心。血液標(biao)
本盡(jin)可(ke)能的(de)不(bu)要使用(yong)溶血(xue)或高血(xue)脂(zhi)血(xue)。如果血(xue)清中(zhong)含(han)大量(liang)顆粒，檢(jian)測前(qian)先離心或過濾。不(bu)要在37℃或更高的(de)溫(wen)度(du)加熱解
凍(dong)(dong)。應在室溫(wen)下解凍(dong)(dong)并確保(bao)樣品(pin)均勻地充分(fen)解凍(dong)(dong)。
Mouse mammary carcinoma Marker-CA153 Elisa Kit操(cao)作(zuo)步(bu)驟：
1. 取出試(shi)劑(ji)盒(he)，室溫（20-25℃）放置 30 分鐘(zhong)。
2. 分組：取出 96 孔(kong)板，根據待測樣品(pin)數(shu)量加上標(biao)準品(pin)的數(shu)量決(jue)定所(suo)需的板條數(shu)，把剩余的板條繼續冷藏處理。分別(bie)設標(biao)準
品組（6 個濃度(du)）、空白孔、待測樣品組。
注(zhu)：為減(jian)少(shao)實(shi)驗誤差(cha)，保(bao)證準確性，建議設置復孔。
3. 加樣：依照標準品(pin)的順序分別加入 50ul 的標準品(pin)溶液于空(kong)白微孔(kong)中(zhong)；空(kong)白對照孔(kong)加入 50ul 的蒸餾水；其(qi)余微孔(kong)中(zhong)加入 50ul
的待測樣本(ben)。
4. 加酶(mei)標(biao)(biao)溶液：標(biao)(biao)準品(pin)組、待測樣(yang)本組各孔中加入 100ul 的酶(mei)標(biao)(biao)溶液（空白(bai)對照孔除(chu)外）。
5. 溫育：酶標板用封板紙(zhi)密封后(hou)，放入濕盒內(nei)于 37℃恒(heng)溫孵育 1 小時。
6. 洗(xi)板：用稀釋后的洗(xi)滌(di)液注滿每孔(kong)，靜置 15-30s，充分清洗(xi)酶標板 5 次，用吸水紙徹底拍(pai)干。
7. 顯(xian)色(se)：各孔加(jia)入顯(xian)色(se)劑 A 液 50ul 后(hou)，再加(jia)入顯(xian)色(se)劑 B 液 50ul。
8. 終止：25-37℃下避光反應(ying) 10-15 分(fen)鐘(zhong)，加(jia)入(ru) 50ul 終止液(ye)。
9. 讀(du)板：在(zai) 450nm 波長讀(du)取各孔(kong)的 OD 值。
豬β-防御素129(PBD129)酶聯免疫分析注意事項(xiang)：
1. 實驗操作中必須使(shi)用一(yi)次性(xing)吸頭，避免交(jiao)叉污染。
2. 加樣：加樣時，要控制加樣速度(du)，避免**孔與最后一孔間(jian)的(de)時間(jian)間(jian)隔過大(da)，否(fou)則將會導(dao)致不同的(de)預(yu)孵(fu)育時間(jian)，從而影響(xiang)
實驗的準確性以(yi)及重復性。
3. 孵育：嚴(yan)格按照說明書(shu)上規定的孵育時間(jian)和溫度進行。
4. 反(fan)(fan)應(ying)(ying)時(shi)間的控制：加入底物后請(qing)定時(shi)觀察反(fan)(fan)應(ying)(ying)孔的顏色變化，如果(guo)顏色較深(shen)，請(qing)提前加入終止(zhi)液終止(zhi)反(fan)(fan)應(ying)(ying)。
5. 建議實(shi)驗前預(yu)測樣(yang)品含量，如樣(yang)品濃度(du)過高，應對樣(yang)品進行(xing)稀(xi)釋(shi)，計(ji)算結(jie)果(guo)時乘以(yi)相應的稀(xi)釋(shi)倍數。
6. 建議使(shi)用(yong)本試(shi)(shi)劑盒時(shi)先(xian)做(zuo)預實驗（即(ji)先(xian)做(zuo)標(biao)準曲線(xian)，試(shi)(shi)用(yong)幾個(ge)標(biao)本），如(ru)果(guo)對本試(shi)(shi)劑盒有(you)任何疑問，可(ke)和所購經(jing)銷商聯(lian)系，
如果(guo)因運輸過程導致試劑盒(he)失效(xiao)，可要求調換(huan)，但概不承擔產品(pin)本身以外的任何損(sun)失。
豬β-防(fang)御素129(PBD129)酶(mei)聯免疫分析性能
1. 靈敏度：最小(xiao)的檢測濃(nong)度小(xiao)于(yu)1號標準品(pin)。稀(xi)釋度的線性。樣品(pin)線性回(hui)歸與預期濃(nong)度相關系數(shu)R值為0.990。
2. 特異(yi)性：不與其它細胞因子反應。
3. 重復性：板內、板間變異系數均(jun)小(xiao)于10%。
結果判斷與分析
1、儀器值：于波長450nm的(de)酶標(biao)儀上讀取各孔的(de)OD值
2、以吸光度(du)(du)OD值為(wei)縱坐標(biao)（Y），相(xiang)應(ying)(ying)的(de)(de)待測(ce)物質(zhi)標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)(pin)濃度(du)(du)為(wei)橫坐標(biao)（X），做得相(xiang)應(ying)(ying)的(de)(de)曲(qu)線，樣品(pin)(pin)的(de)(de)待測(ce)物質(zhi)含(han)量可(ke)根據其OD值由標(biao)準(zhun)(zhun)曲(qu)線換算出相(xiang)應(ying)(ying)的(de)(de)濃度(du)(du)。
