TGF-α Elisa Kit用途：
本試劑盒僅(jin)供科(ke)研使用，定量(liang)檢測細胞液、體液、組織、血清、血漿等標本中TGF-α的含量。
原理：
采用雙抗體夾(jia)心(xin)法測定TGF-α水平。用純化的TGF-α抗體包被微孔板，制成固相載
體，實驗(yan)時依次在微孔板中加(jia)入(ru)樣(yang)本及(ji)標準品，并加(jia)入(ru) HRP 標記的 ABP 抗體，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，反復洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化為藍色，再用硫酸終止反應，轉變成黃色。顏色的深淺和樣品中的 ABP含量呈正相關。采用酶標儀在 450nm 波長測定吸光度（OD 值），根據標準曲線，計算測試樣品中 ABP 濃度。
TGF-α Elisa Kit試劑盒組成(cheng)：
1 | 30 倍濃縮洗滌(di)液 | 20ml×1 瓶 | 7 | 終止液 | 6ml×1 瓶 |
2 | 酶標試劑(ji) | 6ml×1瓶 | 8 | 陽(yang)性(xing)對照 | 0.5ml×1 瓶 |
3 | 酶標包被板 | 12 孔×8 條 | 9 | 陰(yin)性對照 | 0.5ml×1 瓶 |
4 | 樣品稀(xi)釋液(ye) | 6ml×1 瓶 | 10 | 說明(ming)書 | 1 份(fen) |
5 | 顯色劑 A 液(ye) | 6ml×1 瓶 | 11 | 封板膜 | 2 張 |
6 | 顯(xian)色劑 B 液(ye) | 6ml×1/瓶 | 12 | 密封袋(dai) | 1 個(ge) |
TGF-α Elisa Kit實(shi)驗材料與(yu)試劑配制：
1. 儀器與材料：酶標儀（使(shi)用前預熱30分鐘），微量(liang)加液(ye)器、吸頭、蒸餾水(shui)或(huo)去離子水(shui)，濾紙。
2. 緩沖液使用：加(jia)5ul 的(de)(de)緩沖液于(yu)50ul 的(de)(de)樣(yang)品(pin)(pin)(pin)中，如果樣(yang)品(pin)(pin)(pin)量(liang)不(bu)夠或(huo)者(zhe)不(bu)確(que)定，緩沖液和樣(yang)品(pin)(pin)(pin)的(de)(de)混合比例不(bu)要小于(yu)1:10即(ji)可(ke)。
混勻，靜置1小時備用（如果標本是血清或者血漿，此步驟忽略）。
3. 洗(xi)液的配制(zhi)：按1:100的比例配制(zhi)洗(xi)液備用(yong)。
樣品(pin)收(shou)集、處理及保存：
1. 細胞培(pei)養(yang)上清(qing)：適用于檢測(ce)體外(wai)培(pei)養(yang)的細胞分(fen)泌性成份(fen)。用無(wu)菌(jun)管收(shou)(shou)集細胞上清(qing)液，以1000×g離(li)心15分(fen)鐘(zhong)，收(shou)(shou)集上清(qing)。
2. 細(xi)胞：用PBS反復洗(xi)滌細(xi)胞3次，調(diao)整細(xi)胞濃度達到(dao)104
-106
/ml 左右(you)，通(tong)過反復凍融，使細(xi)胞破壞并放出細(xi)胞內成份，或(huo)
者(zhe)細胞超聲粉碎，離(li)心取上清液檢測(ce)。
3. 血(xue)清(qing)(qing)：在室溫(wen)下，血(xue)液自然凝(ning)固，以1000×g離心15分鐘，取(qu)上(shang)清(qing)(qing)待測。
4. 血漿：應根據(ju)標本的要求選擇EDTA 或(huo)檸檬酸鈉作為抗(kang)凝(ning)劑，混合后靜置(zhi)10-20 分鐘后，以1000×g離(li)心15分鐘，收集上
清。
5. 體液(ye)：包括(kuo)胸腹(fu)水、腦脊液(ye)，分泌物等(deng)。使(shi)用不含(han)熱原和內毒素的離心管收集，以(yi)1000×g離心15分鐘，收集上清。
6. 組織(zhi)標本：切取(qu)組織(zhi)標本，稱取(qu)重量0.5mg，加入500ul 的PBS，用手(shou)工或勻漿器(qi)，或超(chao)聲破碎儀將(jiang)標本勻漿，以(yi)2000-3000
rmp離(li)心20 分鐘，收集上清進行檢測(ce)。
7. 樣品中(zhong)不(bu)能含(han)有(you)NaN3，因NaN3 抑制(zhi)辣根過氧(yang)化物酶的(de)（HRP）活性。
8. 保存：如果樣品不能立(li)即檢(jian)測，應將其分裝，-70 ℃保存，避免反復冷凍。保存過程中如出現(xian)沉淀，應再次離心。血液標
本(ben)盡可能的不要使(shi)用溶血(xue)(xue)或高血(xue)(xue)脂血(xue)(xue)。如果血(xue)(xue)清(qing)中含大量顆粒(li)，檢測前(qian)先(xian)離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解
凍。應在(zai)室溫下解凍并確(que)保樣品均勻地充分解凍。
TGF-α Elisa Kit操作步驟：
1. 取(qu)出試劑盒(he)，室溫（20-25℃）放置 30 分鐘。
2. 分(fen)組：取出 96 孔(kong)板(ban)(ban)，根(gen)據待測樣品(pin)數(shu)量(liang)加上標準品(pin)的數(shu)量(liang)決定所需的板(ban)(ban)條數(shu)，把(ba)剩余的板(ban)(ban)條繼續冷藏處理。分(fen)別設標準
品組（6 個濃度）、空白孔、待測樣品組。
注：為減少實驗誤(wu)差，保證準確性，建議(yi)設置復孔。
3. 加(jia)樣：依照(zhao)標準品(pin)的順序分(fen)別加(jia)入 50ul 的標準品(pin)溶液于空白微孔(kong)(kong)中；空白對照(zhao)孔(kong)(kong)加(jia)入 50ul 的蒸餾水；其余微孔(kong)(kong)中加(jia)入 50ul
的(de)待(dai)測樣(yang)本。
4. 加酶標(biao)溶(rong)液：標(biao)準品組(zu)、待(dai)測樣本(ben)組(zu)各(ge)孔(kong)中加入 100ul 的酶標(biao)溶(rong)液（空白對照孔(kong)除外）。
5. 溫育(yu)：酶標(biao)板用封板紙密封后(hou)，放入濕(shi)盒內(nei)于 37℃恒(heng)溫孵育(yu) 1 小時。
6. 洗板：用(yong)稀(xi)釋后的洗滌液注滿每孔，靜置(zhi) 15-30s，充分清洗酶(mei)標板 5 次(ci)，用(yong)吸水紙徹底拍干。
7. 顯(xian)色：各孔加入(ru)顯(xian)色劑(ji) A 液 50ul 后，再加入(ru)顯(xian)色劑(ji) B 液 50ul。
8. 終(zhong)止：25-37℃下(xia)避光反(fan)應 10-15 分(fen)鐘(zhong)，加入(ru) 50ul 終(zhong)止液。
9. 讀板(ban)：在 450nm 波長讀取各(ge)孔的(de) OD 值。
TGF-α Elisa Kit注意事項：
1. 實驗操作中必須使(shi)用一次性吸頭，避(bi)免交叉污染(ran)。
2. 加(jia)(jia)樣(yang)：加(jia)(jia)樣(yang)時，要控(kong)制(zhi)加(jia)(jia)樣(yang)速度，避免**孔(kong)與最后一(yi)孔(kong)間(jian)的時間(jian)間(jian)隔過(guo)大，否則將會導致不同的預孵育(yu)時間(jian)，從而影(ying)響
實驗(yan)的準(zhun)確性(xing)以及(ji)重復性(xing)。
3. 孵育：嚴(yan)格(ge)按照說(shuo)明書上規定的孵育時間(jian)和溫(wen)度進行。
4. 反(fan)應(ying)時間(jian)的控(kong)制(zhi)：加入底(di)物后(hou)請定時觀察(cha)反(fan)應(ying)孔的顏色(se)變化，如果顏色(se)較深，請提前(qian)加入終(zhong)止液(ye)終(zhong)止反(fan)應(ying)。
5. 建議實驗(yan)前預測樣品(pin)含量，如樣品(pin)濃(nong)度過(guo)高(gao)，應對樣品(pin)進行稀釋(shi)(shi)，計(ji)算結果時乘以相(xiang)應的(de)稀釋(shi)(shi)倍(bei)數。
6. 建議使(shi)用(yong)本(ben)試劑(ji)盒時先(xian)做預實驗（即先(xian)做標準曲線，試用(yong)幾(ji)個標本(ben)），如(ru)果對本(ben)試劑(ji)盒有(you)任何疑問，可和所購經銷(xiao)商聯系，
如果因運輸過(guo)程導(dao)致(zhi)試劑盒失(shi)效(xiao)，可要求調(diao)換，但(dan)概不(bu)承(cheng)擔產(chan)品本(ben)身以(yi)外的任(ren)何損失(shi)。
TGF-α Elisa Kit性能
1. 靈敏度：最(zui)小(xiao)的檢測濃度小(xiao)于1號標(biao)準品(pin)。稀釋度的線(xian)性(xing)(xing)。樣品(pin)線(xian)性(xing)(xing)回歸(gui)與(yu)預期濃度相關系數R值為(wei)0.990。
2. 特異性：不與其它細(xi)胞(bao)因子反應。
3. 重復性(xing)：板內、板間變異系數均小于10%。
結果判斷與分析
1、儀(yi)器值(zhi)(zhi)：于(yu)波長450nm的(de)酶標(biao)儀(yi)上讀取(qu)各孔(kong)的(de)OD值(zhi)(zhi)
2、以吸光度OD值(zhi)為縱坐(zuo)標(biao)(biao)（Y），相應的待測物質(zhi)標(biao)(biao)準品濃度為橫坐(zuo)標(biao)(biao)（X），做得相應的曲(qu)線，樣品的待測物質(zhi)含(han)量可根(gen)據其(qi)OD值(zhi)由標(biao)(biao)準曲(qu)線換(huan)算出相應的濃度。
