Ub Elisa Kit 用途：
本試(shi)劑盒僅供科(ke)研使用，定量檢測細胞(bao)液(ye)、體液(ye)、組織、血清(qing)、血漿等標(biao)本中Ub 的含量。
原理：
采(cai)用雙抗體夾心(xin)法測定Ub 水平。用純化的Ub 抗體包被微孔板，制成固相載
體，實驗時依次在微孔板中加(jia)入(ru)樣本及標準品，并加(jia)入(ru) HRP 標記的 ABP 抗體，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，反復洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化為藍色，再用硫酸終止反應，轉變成黃色。顏色的深淺和樣品中的 ABP含量呈正相關。采用酶標儀在 450nm 波長測定吸光度（OD 值），根據標準曲線，計算測試樣品中 ABP 濃度。
Ub Elisa Kit 試劑盒組成：
1 | 30 倍濃縮洗滌液 | 20ml×1 瓶 | 7 | 終止(zhi)液(ye) | 6ml×1 瓶 |
2 | 酶(mei)標試劑 | 6ml×1瓶 | 8 | 陽性對照(zhao) | 0.5ml×1 瓶 |
3 | 酶(mei)標(biao)包被板(ban) | 12 孔×8 條(tiao) | 9 | 陰(yin)性對照(zhao) | 0.5ml×1 瓶(ping) |
4 | 樣品稀釋液 | 6ml×1 瓶 | 10 | 說明書(shu) | 1 份 |
5 | 顯色(se)劑 A 液 | 6ml×1 瓶 | 11 | 封板膜 | 2 張 |
6 | 顯色劑 B 液 | 6ml×1/瓶 | 12 | 密封袋 | 1 個(ge) |
Ub Elisa Kit 實驗(yan)材料與試劑(ji)配(pei)制：
1. 儀(yi)器與材料：酶標儀(yi)（使用前(qian)預(yu)熱(re)30分鐘），微量加液器、吸頭、蒸餾(liu)水或(huo)去離(li)子水，濾紙。
2. 緩(huan)沖液(ye)(ye)使用：加(jia)5ul 的緩(huan)沖液(ye)(ye)于50ul 的樣(yang)品(pin)(pin)中，如果樣(yang)品(pin)(pin)量不夠(gou)或者不確定(ding)，緩(huan)沖液(ye)(ye)和(he)樣(yang)品(pin)(pin)的混合比例不要小(xiao)于1:10即可。
混勻，靜置1小時備用（如果標本是血清或者血漿，此步驟忽略）。
3. 洗液(ye)的(de)(de)配制(zhi)：按1:100的(de)(de)比例(li)配制(zhi)洗液(ye)備(bei)用。
樣品(pin)收集、處理及保存：
1. 細(xi)胞培養上(shang)清(qing)：適(shi)用于檢測體外培養的細(xi)胞分(fen)泌性成份。用無菌管收(shou)集細(xi)胞上(shang)清(qing)液，以1000×g離心(xin)15分(fen)鐘，收(shou)集上(shang)清(qing)。
2. 細胞(bao)：用PBS反(fan)復洗(xi)滌細胞(bao)3次，調整(zheng)細胞(bao)濃度(du)達到104
-106
/ml 左(zuo)右，通過反復凍(dong)融，使細(xi)胞破壞并放出細(xi)胞內成份，或
者細胞超聲粉碎，離心取上(shang)清液(ye)檢測(ce)。
3. 血清：在室(shi)溫下(xia)，血液自然凝固，以(yi)1000×g離(li)心(xin)15分鐘，取上(shang)清待測。
4. 血漿：應根據(ju)標本(ben)的要求選擇(ze)EDTA 或檸(ning)檬酸鈉作(zuo)為抗(kang)凝劑，混合后靜置10-20 分(fen)鐘后，以(yi)1000×g離(li)心15分(fen)鐘，收集上
清(qing)。
5. 體液：包(bao)括胸(xiong)腹水、腦脊液，分(fen)泌物(wu)等(deng)。使用(yong)不含熱原(yuan)和內毒(du)素的離心管收集，以1000×g離心15分(fen)鐘，收集上(shang)清。
6. 組織標本：切取(qu)組織標本，稱取(qu)重量(liang)0.5mg，加(jia)入500ul 的(de)PBS，用手工或勻漿器，或超聲破(po)碎(sui)儀將(jiang)標本勻漿，以2000-3000
rmp離心20 分鐘，收(shou)集上清進行檢(jian)測。
7. 樣品中不(bu)能含(han)有NaN3，因(yin)NaN3 抑制辣根(gen)過氧化物酶的(de)（HRP）活性。
8. 保存：如果(guo)樣(yang)品(pin)不能立即(ji)檢測，應將其分裝，-70 ℃保存，避免反復冷凍。保存過程中如出現沉淀(dian)，應再次(ci)離心。血液標
本盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如(ru)果血清中(zhong)含大(da)量(liang)顆粒(li)，檢測前(qian)先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解
凍。應在室溫下(xia)解凍并確保樣品均勻地充(chong)分解凍。
Ub Elisa Kit 操作步驟：
1. 取(qu)出(chu)試劑盒，室溫(wen)（20-25℃）放置 30 分鐘。
2. 分組：取出 96 孔板，根據待測樣品(pin)數(shu)量加上標準(zhun)品(pin)的(de)數(shu)量決定所需的(de)板條(tiao)數(shu)，把(ba)剩(sheng)余(yu)的(de)板條(tiao)繼(ji)續冷藏處理。分別設標準(zhun)
品組（6 個濃度）、空白孔、待測樣品組。
注：為減少(shao)實(shi)驗(yan)誤(wu)差，保證準(zhun)確(que)性，建議設置復孔。
3. 加(jia)樣：依照(zhao)標準品(pin)的(de)(de)順(shun)序分別加(jia)入(ru)(ru) 50ul 的(de)(de)標準品(pin)溶液于空白微(wei)孔中(zhong)；空白對照(zhao)孔加(jia)入(ru)(ru) 50ul 的(de)(de)蒸餾水；其余微(wei)孔中(zhong)加(jia)入(ru)(ru) 50ul
的待測(ce)樣(yang)本。
4. 加酶標(biao)溶液：標(biao)準品組(zu)(zu)、待測樣本(ben)組(zu)(zu)各(ge)孔中加入(ru) 100ul 的酶標(biao)溶液（空白對照(zhao)孔除外）。
5. 溫育：酶標板用封(feng)板紙密封(feng)后，放入濕(shi)盒(he)內(nei)于 37℃恒溫孵育 1 小時(shi)。
6. 洗(xi)板：用稀釋后的洗(xi)滌(di)液(ye)注滿(man)每孔，靜置 15-30s，充分(fen)清洗(xi)酶標板 5 次(ci)，用吸(xi)水紙徹(che)底拍干。
7. 顯(xian)色(se)：各孔加入顯(xian)色(se)劑(ji) A 液(ye) 50ul 后，再加入顯(xian)色(se)劑(ji) B 液(ye) 50ul。
8. 終止：25-37℃下避光反(fan)應 10-15 分鐘，加入 50ul 終止液。
9. 讀板(ban)：在 450nm 波長(chang)讀取各孔的 OD 值。
Ub Elisa Kit 注意事項：
1. 實(shi)驗操作中必須(xu)使用(yong)一次性(xing)吸頭，避免交叉污染。
2. 加樣(yang)：加樣(yang)時，要控制(zhi)加樣(yang)速度(du)，避免**孔與最(zui)后一孔間(jian)(jian)(jian)的時間(jian)(jian)(jian)間(jian)(jian)(jian)隔過(guo)大(da)，否(fou)則將會導(dao)致不同的預孵育時間(jian)(jian)(jian)，從而影響
實(shi)驗的準確性以及重復性。
3. 孵育：嚴格按照說明(ming)書(shu)上規定(ding)的(de)孵育時間和溫度進行(xing)。
4. 反(fan)應時(shi)(shi)間(jian)的控制：加(jia)入底物(wu)后請(qing)定時(shi)(shi)觀察反(fan)應孔的顏色變化，如果顏色較深，請(qing)提前(qian)加(jia)入終(zhong)(zhong)止液終(zhong)(zhong)止反(fan)應。
5. 建議實驗前預測樣品(pin)(pin)(pin)含量，如(ru)樣品(pin)(pin)(pin)濃度過高，應對樣品(pin)(pin)(pin)進行(xing)稀釋，計算結(jie)果時乘(cheng)以相(xiang)應的稀釋倍(bei)數。
6. 建議(yi)使用本(ben)試劑盒時先做(zuo)預實驗（即先做(zuo)標準(zhun)曲線，試用幾個標本(ben)），如果對本(ben)試劑盒有任何疑問(wen)，可和所購經銷商(shang)聯系(xi)，
如果因運輸過(guo)程(cheng)導致試劑盒失效，可(ke)要求調換(huan)，但概不承擔產品(pin)本身(shen)以外的任何損(sun)失。
Ub Elisa Kit 性能
1. 靈敏度(du)(du)：最小(xiao)的(de)檢(jian)測(ce)濃度(du)(du)小(xiao)于1號標準品。稀釋度(du)(du)的(de)線性。樣品線性回歸與預期濃度(du)(du)相關系數R值為0.990。
2. 特(te)異性(xing)：不(bu)與其它(ta)細胞因子反(fan)應。
3. 重復性：板(ban)(ban)內、板(ban)(ban)間變異系數均小(xiao)于10%。
結果判斷與分析
1、儀器(qi)值(zhi)：于波長450nm的酶標儀上(shang)讀取各(ge)孔的OD值(zhi)
2、以吸(xi)光度(du)OD值(zhi)為(wei)縱(zong)坐標(biao)（Y），相(xiang)應(ying)的(de)待測物(wu)質標(biao)準品濃度(du)為(wei)橫(heng)坐標(biao)（X），做得相(xiang)應(ying)的(de)曲線(xian)，樣(yang)品的(de)待測物(wu)質含量(liang)可根據其OD值(zhi)由(you)標(biao)準曲線(xian)換算出(chu)相(xiang)應(ying)的(de)濃度(du)。
