VEGFR-3/Flt-4 Elisa Kit 用途：
本(ben)試劑(ji)盒僅供科研使用，定量檢測細胞(bao)液、體液、組(zu)織(zhi)、血清、血漿(jiang)等標本(ben)中VEGFR-3/Flt-4 的含量。
原(yuan)理：
采(cai)用(yong)雙抗體夾心(xin)法測定VEGFR-3/Flt-4 水平。用純化的VEGFR-3/Flt-4 抗體包被微孔板，制成固相載
體(ti)，實驗時依(yi)次在微孔板中(zhong)加入(ru)樣本及標準品(pin)，并(bing)加入(ru) HRP 標記的 ABP 抗體，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，反復洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化為藍色，再用硫酸終止反應，轉變成黃色。顏色的深淺和樣品中的 ABP含量呈正相關。采用酶標儀在 450nm 波長測定吸光度（OD 值），根據標準曲線，計算測試樣品中 ABP 濃度。
VEGFR-3/Flt-4 Elisa Kit 試(shi)劑(ji)盒組成(cheng)：
1 | 30 倍濃縮洗(xi)滌液(ye) | 20ml×1 瓶 | 7 | 終止液 | 6ml×1 瓶 |
2 | 酶標試劑 | 6ml×1瓶 | 8 | 陽性(xing)對照(zhao) | 0.5ml×1 瓶 |
3 | 酶標包被(bei)板 | 12 孔(kong)×8 條 | 9 | 陰(yin)性對照 | 0.5ml×1 瓶(ping) |
4 | 樣品稀(xi)釋(shi)液 | 6ml×1 瓶 | 10 | 說明書 | 1 份 |
5 | 顯(xian)色(se)劑 A 液(ye) | 6ml×1 瓶 | 11 | 封(feng)板膜 | 2 張(zhang) |
6 | 顯色劑 B 液(ye) | 6ml×1/瓶 | 12 | 密封(feng)袋(dai) | 1 個 |
VEGFR-3/Flt-4 Elisa Kit 實(shi)驗材(cai)料與試(shi)劑配制(zhi)：
1. 儀器與材料：酶標儀（使用(yong)前預熱30分鐘(zhong)），微量加液器、吸頭、蒸(zheng)餾水或(huo)去離(li)子(zi)水，濾紙。
2. 緩沖液(ye)使用：加5ul 的緩沖液(ye)于(yu)50ul 的樣(yang)品(pin)中，如果(guo)樣(yang)品(pin)量不(bu)夠或(huo)者不(bu)確定，緩沖液(ye)和樣(yang)品(pin)的混合比例不(bu)要小于(yu)1:10即可。
混勻(yun)，靜(jing)置(zhi)1小時備用（如果標本是血清或者血漿，此步驟忽略）。
3. 洗液(ye)的(de)配(pei)制：按1:100的(de)比例配(pei)制洗液(ye)備(bei)用。
樣品收(shou)集、處理及保存：
1. 細胞培養上清(qing)：適(shi)用(yong)于檢測體(ti)外培養的(de)細胞分(fen)泌性成份(fen)。用(yong)無菌管收集(ji)細胞上清(qing)液，以(yi)1000×g離心15分(fen)鐘(zhong)，收集(ji)上清(qing)。
2. 細胞(bao)(bao)：用PBS反復洗滌細胞(bao)(bao)3次，調整細胞(bao)(bao)濃度達到104
-106
/ml 左右，通過反復凍融，使細胞破壞并放出細胞內成份，或
者(zhe)細(xi)胞(bao)超(chao)聲粉碎(sui)，離心取上清(qing)液檢測。
3. 血(xue)清：在室溫下(xia)，血(xue)液自然凝固，以1000×g離心15分鐘，取上清待測。
4. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA 或檸檬酸(suan)鈉作為(wei)抗凝劑，混合(he)后靜置10-20 分(fen)鐘后，以1000×g離心(xin)15分(fen)鐘，收(shou)集上(shang)
清。
5. 體液：包括胸腹水、腦脊液，分(fen)泌物等。使用不含(han)熱原和內毒素(su)的離心管收集，以1000×g離心15分(fen)鐘(zhong)，收集上清(qing)。
6. 組織(zhi)標本：切(qie)取(qu)組織(zhi)標本，稱取(qu)重(zhong)量0.5mg，加入500ul 的PBS，用(yong)手工或(huo)勻(yun)漿器(qi)，或(huo)超聲破碎儀將(jiang)標本勻(yun)漿，以2000-3000
rmp離(li)心(xin)20 分鐘，收集上清(qing)進行檢測。
7. 樣品中不能(neng)含(han)有NaN3，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性(xing)。
8. 保存(cun)：如果(guo)樣品(pin)不(bu)能立(li)即檢測，應將(jiang)其(qi)分裝，-70 ℃保存(cun)，避免(mian)反復冷凍。保存(cun)過程(cheng)中如出現沉淀(dian)，應再次離心。血液(ye)標
本(ben)盡可能(neng)的不要使用溶血(xue)(xue)或(huo)高(gao)血(xue)(xue)脂血(xue)(xue)。如果血(xue)(xue)清中含大量顆粒，檢測前(qian)先離心(xin)或(huo)過(guo)濾。不要在(zai)37℃或更高的溫度加熱解
凍。應在室溫下解凍并確保樣品(pin)均(jun)勻地充分(fen)解凍。
VEGFR-3/Flt-4 Elisa Kit 操作步(bu)驟：
1. 取出試劑盒，室溫（20-25℃）放置 30 分鐘。
2. 分組：取出 96 孔板，根據待測樣品(pin)數量加上(shang)標準(zhun)品(pin)的數量決定所需的板條(tiao)數，把剩余的板條(tiao)繼續冷藏處理(li)。分別設標準(zhun)
品(pin)組（6 個濃度）、空白孔、待測樣品組。
注：為減(jian)少實驗誤差，保證準(zhun)確性，建議設置(zhi)復孔。
3. 加樣：依照(zhao)標準品的(de)(de)順序(xu)分別加入(ru)(ru) 50ul 的(de)(de)標準品溶(rong)液于空白(bai)微(wei)孔(kong)中(zhong)；空白(bai)對(dui)照(zhao)孔(kong)加入(ru)(ru) 50ul 的(de)(de)蒸餾水；其余微(wei)孔(kong)中(zhong)加入(ru)(ru) 50ul
的(de)待測樣(yang)本(ben)。
4. 加酶標(biao)溶液(ye)：標(biao)準品組、待(dai)測(ce)樣本組各孔中(zhong)加入(ru) 100ul 的(de)酶標(biao)溶液(ye)（空白(bai)對照孔除(chu)外(wai)）。
5. 溫育(yu)：酶標(biao)板用封板紙密(mi)封后，放(fang)入(ru)濕盒內于 37℃恒溫孵(fu)育(yu) 1 小(xiao)時。
6. 洗板：用稀釋后的洗滌液(ye)注滿每孔，靜置 15-30s，充分清洗酶標板 5 次，用吸水紙徹底拍干(gan)。
7. 顯(xian)(xian)色(se)：各(ge)孔加入顯(xian)(xian)色(se)劑 A 液 50ul 后，再加入顯(xian)(xian)色(se)劑 B 液 50ul。
8. 終止(zhi)：25-37℃下避光反應 10-15 分鐘，加入 50ul 終止(zhi)液。
9. 讀(du)板：在 450nm 波長讀(du)取(qu)各孔的(de) OD 值。
VEGFR-3/Flt-4 Elisa Kit 注意事項：
1. 實驗操作中必須使(shi)用一(yi)次性(xing)吸(xi)頭，避免交叉(cha)污染(ran)。
2. 加樣：加樣時(shi)，要控制加樣速度(du)，避免**孔與最后一孔間(jian)的時(shi)間(jian)間(jian)隔過大，否則將會導致不同的預孵育(yu)時(shi)間(jian)，從而(er)影響
實驗的準確性以(yi)及重復(fu)性。
3. 孵育：嚴格按照說(shuo)明書上規定的孵育時間(jian)和溫度進行。
4. 反(fan)(fan)應(ying)時(shi)間(jian)的控(kong)制：加入(ru)底物后請定時(shi)觀察反(fan)(fan)應(ying)孔(kong)的顏色(se)變化，如果顏色(se)較深(shen)，請提前加入(ru)終(zhong)止液終(zhong)止反(fan)(fan)應(ying)。
5. 建議實(shi)驗(yan)前預(yu)測樣(yang)品(pin)含量，如(ru)樣(yang)品(pin)濃度過高，應對樣(yang)品(pin)進(jin)行稀(xi)釋，計算結果時(shi)乘以相應的稀(xi)釋倍數。
6. 建議使用(yong)本(ben)試劑(ji)盒時先(xian)(xian)做預實驗（即先(xian)(xian)做標(biao)準曲線，試用(yong)幾(ji)個標(biao)本(ben)），如果對本(ben)試劑(ji)盒有任何疑(yi)問，可和所(suo)購經銷商聯系，
如果(guo)因運(yun)輸過程導(dao)致(zhi)試劑盒失(shi)效，可要求調換，但概不承擔產品本身以外的任何損失(shi)。
VEGFR-3/Flt-4 Elisa Kit 性(xing)能
1. 靈敏度(du)(du)：最小(xiao)(xiao)的(de)檢測(ce)濃(nong)度(du)(du)小(xiao)(xiao)于1號(hao)標準品。稀釋度(du)(du)的(de)線性(xing)。樣(yang)品線性(xing)回歸(gui)與預期濃(nong)度(du)(du)相關(guan)系數(shu)R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應。
3. 重復性：板內、板間變(bian)異(yi)系(xi)數均小于10%。
結果判斷(duan)與分析(xi)
1、儀(yi)器(qi)值：于波(bo)長(chang)450nm的酶標(biao)儀(yi)上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為(wei)縱坐標(biao)（Y），相(xiang)應的待(dai)測物質標(biao)準(zhun)品濃度為(wei)橫坐標(biao)（X），做得相(xiang)應的曲(qu)線，樣(yang)品的待(dai)測物質含量可根據其OD值由標(biao)準(zhun)曲(qu)線換(huan)算出相(xiang)應的濃度。
