β-EPR Elisa Kit用途：
本試劑盒僅(jin)供科研使用，定(ding)量檢測細(xi)胞(bao)液、體液、組織、血清、血漿等(deng)標本中β-EPR的含量。
原理：
采用(yong)雙抗(kang)體夾心法測定β-EPR水平。用純化的β-EPR抗體包被微孔板，制成固相載
體，實驗(yan)時依(yi)次在(zai)微孔板中(zhong)加入樣本及標準品，并加入 HRP 標記的 ABP 抗體，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，反復洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化為藍色，再用硫酸終止反應，轉變成黃色。顏色的深淺和樣品中的 ABP含量呈正相關。采用酶標儀在 450nm 波長測定吸光度（OD 值），根據標準曲線，計算測試樣品中 ABP 濃度。
β-EPR Elisa Kit試劑盒(he)組成(cheng)：
1 | 30 倍(bei)濃(nong)縮洗滌液 | 20ml×1 瓶 | 7 | 終止液 | 6ml×1 瓶(ping) |
2 | 酶標試劑(ji) | 6ml×1瓶 | 8 | 陽(yang)性對照 | 0.5ml×1 瓶(ping) |
3 | 酶標包被板(ban) | 12 孔×8 條(tiao) | 9 | 陰性對照(zhao) | 0.5ml×1 瓶 |
4 | 樣品稀釋液 | 6ml×1 瓶 | 10 | 說(shuo)明書 | 1 份 |
5 | 顯色劑 A 液 | 6ml×1 瓶 | 11 | 封板膜 | 2 張 |
6 | 顯色劑 B 液 | 6ml×1/瓶 | 12 | 密封袋 | 1 個 |
β-EPR Elisa Kit實驗材料(liao)與試劑配制：
1. 儀器與材料：酶標儀（使用前預熱30分(fen)鐘），微(wei)量(liang)加液(ye)器、吸頭、蒸餾水(shui)或去離子水(shui)，濾(lv)紙(zhi)。
2. 緩(huan)(huan)沖(chong)液(ye)使用(yong)：加(jia)5ul 的(de)緩(huan)(huan)沖(chong)液(ye)于(yu)50ul 的(de)樣(yang)(yang)品(pin)中(zhong)，如(ru)果(guo)樣(yang)(yang)品(pin)量不夠或(huo)者不確定，緩(huan)(huan)沖(chong)液(ye)和樣(yang)(yang)品(pin)的(de)混合比例不要小于(yu)1:10即可。
混勻，靜置1小時備用（如果標本是血清或者血漿，此步驟忽略）。
3. 洗液(ye)的配制：按1:100的比例配制洗液(ye)備用。
樣(yang)品收集(ji)、處(chu)理及保存：
1. 細(xi)胞培(pei)養上清：適用于檢測體外培(pei)養的細(xi)胞分泌(mi)性成(cheng)份。用無菌管收集(ji)細(xi)胞上清液(ye)，以1000×g離心15分鐘，收集(ji)上清。
2. 細(xi)胞(bao)：用(yong)PBS反復洗滌細(xi)胞(bao)3次，調整細(xi)胞(bao)濃度達到(dao)104
-106
/ml 左右，通過反復凍(dong)融(rong)，使細胞破壞并放出細胞內(nei)成份(fen)，或
者細胞超聲(sheng)粉碎(sui)，離心取上(shang)清液(ye)檢測。
3. 血清(qing)：在室溫下(xia)，血液自然凝固，以(yi)1000×g離(li)心15分鐘，取上(shang)清(qing)待測。
4. 血漿：應(ying)根據(ju)標本的要求選擇EDTA 或檸檬酸(suan)鈉作為抗凝劑(ji)，混(hun)合后靜(jing)置10-20 分鐘(zhong)后，以1000×g離(li)心(xin)15分鐘(zhong)，收集上
清。
5. 體液：包括胸(xiong)腹水、腦脊液，分(fen)(fen)泌物等。使用不含熱原(yuan)和內毒素的離(li)心管收集，以1000×g離(li)心15分(fen)(fen)鐘，收集上清(qing)。
6. 組織標本(ben)：切取(qu)(qu)組織標本(ben)，稱取(qu)(qu)重量0.5mg，加(jia)入500ul 的PBS，用(yong)手工或(huo)(huo)勻漿器(qi)，或(huo)(huo)超聲破碎儀(yi)將標本(ben)勻漿，以2000-3000
rmp離心(xin)20 分鐘，收集上清進行檢測。
7. 樣品中(zhong)不能含有(you)NaN3，因NaN3 抑制辣根過氧(yang)化物酶的（HRP）活(huo)性(xing)。
8. 保(bao)存(cun)：如果樣品不(bu)能立即(ji)檢測，應將其分(fen)裝，-70 ℃保(bao)存(cun)，避(bi)免反復(fu)冷凍。保(bao)存(cun)過程中(zhong)如出現沉(chen)淀，應再次離心(xin)。血液標
本盡(jin)可(ke)能的不要使用溶血(xue)或(huo)高(gao)血(xue)脂血(xue)。如果血(xue)清中含(han)大量顆(ke)粒，檢測前先離心或(huo)過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解
凍。應在室(shi)溫下解凍并(bing)確保樣(yang)品均勻地充分解凍。
β-EPR Elisa Kit操作步驟：
1. 取出試劑盒(he)，室(shi)溫（20-25℃）放置 30 分鐘。
2. 分組：取出 96 孔板，根據待(dai)測樣品數量加上標準品的數量決(jue)定(ding)所(suo)需(xu)的板條(tiao)數，把剩余的板條(tiao)繼續冷藏處理。分別設標準
品組（6 個濃度）、空白孔、待測樣品組。
注：為減少實驗(yan)誤差，保證(zheng)準確性，建議設置復孔(kong)。
3. 加(jia)樣：依照標準(zhun)品(pin)的順序分別加(jia)入(ru) 50ul 的標準(zhun)品(pin)溶液于空白微孔中；空白對照孔加(jia)入(ru) 50ul 的蒸餾水；其余微孔中加(jia)入(ru) 50ul
的(de)待測(ce)樣(yang)本。
4. 加(jia)酶(mei)標溶液：標準品組、待測(ce)樣本組各孔中加(jia)入 100ul 的酶(mei)標溶液（空白(bai)對照孔除外(wai)）。
5. 溫育：酶標板(ban)(ban)用封(feng)板(ban)(ban)紙密封(feng)后，放入濕(shi)盒內于 37℃恒溫孵育 1 小時。
6. 洗板(ban)：用稀釋后(hou)的洗滌液注滿(man)每孔，靜置 15-30s，充分清洗酶(mei)標板(ban) 5 次，用吸(xi)水紙徹底(di)拍干。
7. 顯(xian)(xian)色：各孔加(jia)入(ru)(ru)顯(xian)(xian)色劑 A 液 50ul 后，再加(jia)入(ru)(ru)顯(xian)(xian)色劑 B 液 50ul。
8. 終止：25-37℃下避光反(fan)應 10-15 分鐘(zhong)，加入 50ul 終止液。
9. 讀(du)板：在 450nm 波長讀(du)取(qu)各孔的 OD 值。
β-EPR Elisa Kit注意事項：
1. 實驗(yan)操作(zuo)中(zhong)必須使用一次性吸頭，避免交叉(cha)污染。
2. 加樣(yang)：加樣(yang)時，要(yao)控制加樣(yang)速度，避(bi)免**孔(kong)與最后一孔(kong)間的時間間隔過大，否則將會導致不同的預(yu)孵育時間，從而影(ying)響
實驗(yan)的準確性以及重復性。
3. 孵(fu)育：嚴格按照說(shuo)明(ming)書上規定(ding)的孵(fu)育時間和溫度(du)進行。
4. 反(fan)(fan)應(ying)(ying)時間(jian)的控制：加入底(di)物后(hou)請定時觀察反(fan)(fan)應(ying)(ying)孔的顏(yan)色(se)變化，如(ru)果顏(yan)色(se)較深，請提(ti)前加入終止液終止反(fan)(fan)應(ying)(ying)。
5. 建議實驗(yan)前預(yu)測(ce)樣品含(han)量，如樣品濃度過高，應對樣品進行(xing)稀(xi)釋(shi)(shi)，計(ji)算(suan)結果時乘以(yi)相應的稀(xi)釋(shi)(shi)倍數。
6. 建議(yi)使用(yong)本(ben)(ben)試劑(ji)盒時先做預實驗（即先做標準曲線(xian)，試用(yong)幾(ji)個標本(ben)(ben)），如果(guo)對本(ben)(ben)試劑(ji)盒有任何疑問，可和(he)所購經銷商(shang)聯(lian)系，
如果因(yin)運輸過程導致(zhi)試劑盒失效，可要求調換(huan)，但(dan)概不(bu)承擔產(chan)品(pin)本(ben)身以外的任何損(sun)失。
β-EPR Elisa Kit性能
1. 靈敏度：最小(xiao)的(de)檢(jian)測濃度小(xiao)于1號標準(zhun)品。稀釋度的(de)線性(xing)。樣品線性(xing)回歸與預(yu)期濃度相關系數(shu)R值為(wei)0.990。
2. 特異(yi)性：不與其(qi)它細胞因(yin)子反應(ying)。
3. 重復(fu)性(xing)：板內(nei)、板間變異系數均小于10%。
結果判斷與(yu)分析
1、儀器值：于波(bo)長450nm的酶(mei)標儀上讀(du)取(qu)各(ge)孔的OD值
2、以吸光(guang)度OD值(zhi)為縱坐(zuo)標(biao)（Y），相應(ying)的(de)(de)待(dai)測物(wu)(wu)質標(biao)準(zhun)品濃(nong)度為橫(heng)坐(zuo)標(biao)（X），做得(de)相應(ying)的(de)(de)曲線(xian)，樣(yang)品的(de)(de)待(dai)測物(wu)(wu)質含量可根據(ju)其OD值(zhi)由(you)標(biao)準(zhun)曲線(xian)換(huan)算出相應(ying)的(de)(de)濃(nong)度。
