TPO-Ab Elisa Kit 用途：
本(ben)試(shi)劑盒僅供科研(yan)使用(yong)，定量檢測(ce)細(xi)胞液(ye)、體液(ye)、組織、血清、血漿等標本(ben)中TPO-Ab 的含量。
原理：
采(cai)用雙抗體夾心法測定TPO-Ab 水平。用純化的TPO-Ab 抗體包被微孔板，制成固相載
體，實(shi)驗時依次在微孔板中加入樣本及標準品，并加入 HRP 標記的 ABP 抗體，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，反復洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化為藍色，再用硫酸終止反應，轉變成黃色。顏色的深淺和樣品中的 ABP含量呈正相關。采用酶標儀在 450nm 波長測定吸光度（OD 值），根據標準曲線，計算測試樣品中 ABP 濃度。
TPO-Ab Elisa Kit 試劑盒組成：
1 | 30 倍濃縮洗滌液 | 20ml×1 瓶(ping) | 7 | 終止(zhi)液 | 6ml×1 瓶 |
2 | 酶標試劑 | 6ml×1瓶 | 8 | 陽性(xing)對(dui)照 | 0.5ml×1 瓶(ping) |
3 | 酶(mei)標包被板(ban) | 12 孔×8 條 | 9 | 陰性對照 | 0.5ml×1 瓶 |
4 | 樣品(pin)稀釋(shi)液 | 6ml×1 瓶 | 10 | 說明書 | 1 份 |
5 | 顯色劑 A 液(ye) | 6ml×1 瓶 | 11 | 封(feng)板膜 | 2 張 |
6 | 顯色(se)劑 B 液 | 6ml×1/瓶(ping) | 12 | 密封袋 | 1 個(ge) |
TPO-Ab Elisa Kit 實驗材料與(yu)試劑配制(zhi)：
1. 儀器(qi)(qi)與材料(liao)：酶標儀（使用前(qian)預熱(re)30分鐘），微量加液器(qi)(qi)、吸頭、蒸餾水(shui)或去離子水(shui)，濾紙。
2. 緩沖(chong)液使用：加5ul 的緩沖(chong)液于50ul 的樣品(pin)中，如果樣品(pin)量不(bu)夠或者不(bu)確定，緩沖(chong)液和樣品(pin)的混合比例不(bu)要小于1:10即可。
混勻，靜置1小時備用（如果標本是血清或者血漿，此步驟忽略）。
3. 洗液(ye)(ye)的配制：按1:100的比例配制洗液(ye)(ye)備(bei)用。
樣品(pin)收集、處理及保存：
1. 細胞(bao)培養上清：適(shi)用(yong)于檢(jian)測(ce)體外培養的細胞(bao)分(fen)(fen)泌性(xing)成份。用(yong)無菌管收集(ji)細胞(bao)上清液(ye)，以1000×g離心(xin)15分(fen)(fen)鐘，收集(ji)上清。
2. 細(xi)胞：用PBS反(fan)復(fu)洗滌細(xi)胞3次，調整細(xi)胞濃度達(da)到104
-106
/ml 左右，通過反(fan)復凍融(rong)，使細(xi)胞破(po)壞并放出細(xi)胞內成份，或(huo)
者(zhe)細胞(bao)超聲粉碎，離心取上清液檢測。
3. 血(xue)清(qing)：在室溫下，血(xue)液自然凝(ning)固，以1000×g離(li)心15分鐘，取上(shang)清(qing)待測。
4. 血漿：應根據標本的要求(qiu)選(xuan)擇(ze)EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合(he)后靜置10-20 分(fen)鐘(zhong)后，以(yi)1000×g離心(xin)15分(fen)鐘(zhong)，收集上
清(qing)。
5. 體(ti)液：包(bao)括胸腹水、腦(nao)脊液，分(fen)泌(mi)物等。使用不含熱原和內毒素(su)的離心(xin)(xin)管收(shou)集，以1000×g離心(xin)(xin)15分(fen)鐘，收(shou)集上清(qing)。
6. 組織標(biao)本：切取(qu)組織標(biao)本，稱取(qu)重量0.5mg，加(jia)入500ul 的(de)PBS，用(yong)手(shou)工(gong)或勻漿(jiang)器(qi)，或超(chao)聲破(po)碎儀將標(biao)本勻漿(jiang)，以2000-3000
rmp離(li)心20 分(fen)鐘，收集(ji)上清進行檢測。
7. 樣(yang)品(pin)中(zhong)不能(neng)含(han)有NaN3，因NaN3 抑制辣根過氧化(hua)物酶(mei)的(de)（HRP）活性。
8. 保(bao)存(cun)：如果樣(yang)品不能立即檢測，應(ying)將其(qi)分裝，-70 ℃保(bao)存(cun)，避免(mian)反(fan)復冷凍。保(bao)存(cun)過程(cheng)中(zhong)如出現沉淀，應(ying)再次離心。血液(ye)標
本盡可能的(de)不要使用溶血或高血脂(zhi)血。如果血清中含大量(liang)顆粒，檢測前(qian)先(xian)離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解
凍。應在室溫(wen)下(xia)解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
TPO-Ab Elisa Kit 操作步驟(zou)：
1. 取出(chu)試劑盒，室(shi)溫（20-25℃）放置(zhi) 30 分鐘。
2. 分組：取出 96 孔板，根(gen)據(ju)待測樣品數(shu)(shu)量(liang)(liang)加上標(biao)準品的數(shu)(shu)量(liang)(liang)決定所需的板條數(shu)(shu)，把剩余(yu)的板條繼續冷藏處理。分別設(she)標(biao)準
品組（6 個濃度）、空白孔、待測樣品組。
注：為減少實驗誤差，保證準(zhun)確性，建議(yi)設置復(fu)孔。
3. 加樣：依照(zhao)標準品的順序(xu)分(fen)別加入(ru) 50ul 的標準品溶液于空(kong)白微孔(kong)中(zhong)；空(kong)白對照(zhao)孔(kong)加入(ru) 50ul 的蒸餾(liu)水；其余微孔(kong)中(zhong)加入(ru) 50ul
的待(dai)測樣(yang)本。
4. 加酶(mei)標溶(rong)(rong)液(ye)：標準品(pin)組、待(dai)測樣本組各孔中加入 100ul 的酶(mei)標溶(rong)(rong)液(ye)（空白對照孔除外(wai)）。
5. 溫(wen)育(yu)：酶標板用(yong)封板紙密(mi)封后，放入濕盒內于 37℃恒溫(wen)孵育(yu) 1 小時。
6. 洗板：用(yong)稀(xi)釋后的洗滌(di)液(ye)注滿每孔，靜(jing)置 15-30s，充分清洗酶標板 5 次(ci)，用(yong)吸水紙徹底拍干。
7. 顯色：各孔加(jia)入顯色劑 A 液 50ul 后，再加(jia)入顯色劑 B 液 50ul。
8. 終止：25-37℃下避光反應(ying) 10-15 分鐘(zhong)，加入(ru) 50ul 終止液。
9. 讀板：在 450nm 波長讀取(qu)各孔的 OD 值(zhi)。
TPO-Ab Elisa Kit 注(zhu)意事(shi)項：
1. 實驗操作(zuo)中(zhong)必須使用一次性吸頭(tou)，避免交叉污染(ran)。
2. 加樣：加樣時，要控(kong)制加樣速度，避(bi)免**孔與(yu)最后一(yi)孔間(jian)的時間(jian)間(jian)隔過(guo)大(da)，否則(ze)將會導致不同(tong)的預(yu)孵育時間(jian)，從而影響
實驗的準(zhun)確性(xing)以及重復性(xing)。
3. 孵(fu)育(yu)：嚴格按照說(shuo)明書上規定的孵(fu)育(yu)時間和(he)溫度(du)進行。
4. 反(fan)(fan)應(ying)時(shi)間的控制：加(jia)入底物后(hou)請定時(shi)觀(guan)察(cha)反(fan)(fan)應(ying)孔的顏(yan)(yan)色變化，如果顏(yan)(yan)色較深，請提前加(jia)入終止液(ye)終止反(fan)(fan)應(ying)。
5. 建議實驗前預測樣(yang)(yang)品(pin)含量，如樣(yang)(yang)品(pin)濃(nong)度過(guo)高，應對樣(yang)(yang)品(pin)進行稀(xi)(xi)釋，計算結果(guo)時乘以相應的稀(xi)(xi)釋倍數。
6. 建議使(shi)用本試(shi)(shi)劑(ji)(ji)盒(he)時先(xian)做(zuo)預實(shi)驗(yan)（即先(xian)做(zuo)標(biao)準曲線，試(shi)(shi)用幾(ji)個標(biao)本），如果對本試(shi)(shi)劑(ji)(ji)盒(he)有任何疑(yi)問，可(ke)和所購(gou)經銷商聯系，
如(ru)果因(yin)運輸過程(cheng)導致試劑(ji)盒(he)失效，可要(yao)求調換，但(dan)概不承擔產品本身以(yi)外(wai)的任何損失。
TPO-Ab Elisa Kit 性能
1. 靈敏度(du)：最小(xiao)的(de)(de)檢測濃度(du)小(xiao)于1號標準品。稀釋度(du)的(de)(de)線性(xing)。樣品線性(xing)回歸(gui)與預(yu)期(qi)濃度(du)相(xiang)關(guan)系(xi)數R值為0.990。
2. 特異性：不與(yu)其(qi)它細胞因子反(fan)應。
3. 重復(fu)性(xing)：板內(nei)、板間(jian)變異系數均小于10%。
結果判斷與分析
1、儀(yi)器值：于(yu)波長450nm的(de)酶標儀(yi)上讀(du)取各(ge)孔的(de)OD值
2、以吸光(guang)度OD值(zhi)(zhi)為(wei)縱坐(zuo)標（Y），相應的待測物(wu)質標準品(pin)濃(nong)度為(wei)橫坐(zuo)標（X），做得相應的曲線，樣(yang)品(pin)的待測物(wu)質含量可(ke)根據其OD值(zhi)(zhi)由(you)標準曲線換算(suan)出相應的濃(nong)度。
