β-DF Elisa Kit用途：
本(ben)試劑盒僅供科研使用，定量檢(jian)測細胞液、體液、組織、血(xue)清、血(xue)漿等標本(ben)中β-DF的含量。
原(yuan)理：
采用雙抗體夾(jia)心法測(ce)定β-DF水平。用純化的β-DF抗體包被微孔板，制成固相載
體(ti)，實驗(yan)時依次在微孔板中加入樣本及(ji)標準品，并加入 HRP 標記的 ABP 抗體，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，反復洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化為藍色，再用硫酸終止反應，轉變成黃色。顏色的深淺和樣品中的 ABP含量呈正相關。采用酶標儀在 450nm 波長測定吸光度（OD 值），根據標準曲線，計算測試樣品中 ABP 濃度。
β-DF Elisa Kit試(shi)劑盒組成：
1 | 30 倍(bei)濃(nong)縮洗滌液 | 20ml×1 瓶 | 7 | 終止液 | 6ml×1 瓶 |
2 | 酶標試劑 | 6ml×1瓶(ping) | 8 | 陽性對(dui)照(zhao) | 0.5ml×1 瓶(ping) |
3 | 酶標包被板 | 12 孔×8 條(tiao) | 9 | 陰性(xing)對照(zhao) | 0.5ml×1 瓶 |
4 | 樣品稀釋液 | 6ml×1 瓶 | 10 | 說明書 | 1 份 |
5 | 顯色劑(ji) A 液 | 6ml×1 瓶(ping) | 11 | 封板膜 | 2 張 |
6 | 顯(xian)色劑 B 液 | 6ml×1/瓶(ping) | 12 | 密封袋(dai) | 1 個 |
β-DF Elisa Kit實驗材料與試劑配(pei)制：
1. 儀(yi)器與材料(liao)：酶標儀(yi)（使用前預熱30分鐘），微量(liang)加液器、吸頭、蒸餾水或去離子水，濾(lv)紙。
2. 緩沖液使用：加5ul 的緩沖液于(yu)50ul 的樣品(pin)中，如果樣品(pin)量不(bu)夠或者不(bu)確定，緩沖液和樣品(pin)的混合比例不(bu)要小于(yu)1:10即(ji)可。
混勻(yun)，靜置1小時備用（如果標本是血清或者血漿，此步驟忽略）。
3. 洗(xi)液的配制(zhi)：按(an)1:100的比例配制(zhi)洗(xi)液備用(yong)。
樣(yang)品收集(ji)、處理及(ji)保存：
1. 細(xi)(xi)胞(bao)培養(yang)上清：適用于檢測體外培養(yang)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)分(fen)泌性成份。用無菌管(guan)收集(ji)細(xi)(xi)胞(bao)上清液，以1000×g離心15分(fen)鐘，收集(ji)上清。
2. 細胞：用PBS反(fan)復洗(xi)滌(di)細胞3次，調整(zheng)細胞濃度達到104
-106
/ml 左右(you)，通過反復凍融，使(shi)細胞破壞并放出細胞內成份，或
者細胞超聲粉(fen)碎，離心取上清液檢測。
3. 血清：在室(shi)溫下，血液自然(ran)凝固，以1000×g離心15分鐘(zhong)，取上清待測(ce)。
4. 血漿：應根(gen)據標本的要求選(xuan)擇(ze)EDTA 或(huo)檸檬酸鈉作為抗凝(ning)劑，混合(he)后靜(jing)置10-20 分鐘后，以1000×g離心15分鐘，收集上
清(qing)。
5. 體液：包括胸腹(fu)水、腦脊液，分泌(mi)物等。使(shi)用不含熱原和內毒(du)素的離(li)心(xin)管收集，以1000×g離(li)心(xin)15分鐘(zhong)，收集上清。
6. 組織標本(ben)：切取組織標本(ben)，稱取重(zhong)量0.5mg，加入500ul 的PBS，用手工或(huo)勻(yun)漿(jiang)器，或(huo)超聲破碎儀將標本(ben)勻(yun)漿(jiang)，以2000-3000
rmp離心20 分鐘，收集上清(qing)進行檢(jian)測。
7. 樣品(pin)中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶(mei)的（HRP）活性。
8. 保(bao)存：如(ru)(ru)果樣品不能立即檢測，應將其分裝，-70 ℃保(bao)存，避免反復(fu)冷凍(dong)。保(bao)存過程中如(ru)(ru)出(chu)現(xian)沉淀，應再次離心。血液標
本盡可能(neng)的不要使用(yong)溶血或高血脂血。如果(guo)血清(qing)中含大量顆(ke)粒，檢測前先(xian)離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解
凍(dong)。應(ying)在室溫下解(jie)凍(dong)并確保樣品均(jun)勻地(di)充(chong)分解(jie)凍(dong)。
β-DF Elisa Kit操作步驟(zou)：
1. 取出試劑盒，室溫（20-25℃）放(fang)置 30 分鐘。
2. 分組：取出 96 孔板(ban)，根(gen)據待測(ce)樣品數量(liang)加上標準品的數量(liang)決(jue)定所需的板(ban)條(tiao)數，把剩余的板(ban)條(tiao)繼續冷藏處(chu)理(li)。分別設標準
品組（6 個濃度）、空白孔、待測樣品組。
注(zhu)：為(wei)減少(shao)實驗誤差，保證(zheng)準(zhun)確性，建議設置(zhi)復孔。
3. 加樣：依照(zhao)標準品的順序(xu)分別加入(ru) 50ul 的標準品溶液于空白(bai)微孔中；空白(bai)對照(zhao)孔加入(ru) 50ul 的蒸餾水；其余微孔中加入(ru) 50ul
的(de)待測樣本。
4. 加酶標(biao)溶(rong)液：標(biao)準品組、待測(ce)樣本組各孔(kong)中加入 100ul 的酶標(biao)溶(rong)液（空白對照孔(kong)除外）。
5. 溫育(yu)：酶標板用封(feng)板紙密封(feng)后，放入(ru)濕(shi)盒(he)內于 37℃恒溫孵(fu)育(yu) 1 小時(shi)。
6. 洗(xi)(xi)板：用(yong)稀釋后(hou)的洗(xi)(xi)滌(di)液注滿每(mei)孔，靜(jing)置 15-30s，充分(fen)清(qing)洗(xi)(xi)酶(mei)標板 5 次，用(yong)吸水紙(zhi)徹底拍干。
7. 顯(xian)(xian)色(se)(se)：各孔加(jia)入顯(xian)(xian)色(se)(se)劑 A 液(ye)(ye) 50ul 后，再加(jia)入顯(xian)(xian)色(se)(se)劑 B 液(ye)(ye) 50ul。
8. 終止：25-37℃下避光反應 10-15 分鐘，加入 50ul 終止液。
9. 讀(du)板：在 450nm 波長(chang)讀(du)取各孔(kong)的(de) OD 值。
β-DF Elisa Kit注意事項：
1. 實驗操作中必須使用一次(ci)性吸頭，避(bi)免交(jiao)叉污染(ran)。
2. 加(jia)樣：加(jia)樣時，要(yao)控制加(jia)樣速度，避免**孔(kong)與最后一(yi)孔(kong)間的時間間隔過大，否則(ze)將會(hui)導致不同的預(yu)孵育(yu)時間，從而影(ying)響(xiang)
實驗(yan)的準確性以及(ji)重復性。
3. 孵(fu)育：嚴格按照說明書上規(gui)定的孵(fu)育時間和溫度進(jin)行。
4. 反(fan)應(ying)時間的(de)控制：加(jia)入底物(wu)后請定(ding)時觀察反(fan)應(ying)孔(kong)的(de)顏(yan)(yan)色變化，如果(guo)顏(yan)(yan)色較深，請提前加(jia)入終(zhong)止(zhi)液終(zhong)止(zhi)反(fan)應(ying)。
5. 建議(yi)實驗前預測樣(yang)品(pin)含(han)量(liang)，如樣(yang)品(pin)濃度過高，應對樣(yang)品(pin)進行稀釋，計算結(jie)果(guo)時乘(cheng)以相應的稀釋倍數。
6. 建議使用(yong)本試劑盒時先做預實驗（即先做標準曲線，試用(yong)幾(ji)個標本），如果對(dui)本試劑盒有任何疑問(wen)，可和(he)所購(gou)經(jing)銷(xiao)商聯系，
如果因(yin)運輸過程(cheng)導致試劑盒失效(xiao)，可要求調換(huan)，但(dan)概不承(cheng)擔產(chan)品本身以外的任(ren)何損失。
β-DF Elisa Kit性能
1. 靈敏度(du)：最小的檢(jian)測濃度(du)小于1號(hao)標(biao)準品。稀(xi)釋度(du)的線性。樣品線性回歸與(yu)預期(qi)濃度(du)相關(guan)系(xi)數R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應。
3. 重復(fu)性：板(ban)內、板(ban)間變異系數均小于10%。
結果判斷(duan)與分析
1、儀器值(zhi)：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值(zhi)
2、以吸光度(du)OD值為縱坐標(biao)(biao)（Y），相(xiang)應的待測(ce)物(wu)質標(biao)(biao)準(zhun)品濃度(du)為橫坐標(biao)(biao)（X），做得(de)相(xiang)應的曲(qu)線，樣品的待測(ce)物(wu)質含(han)量可根(gen)據其OD值由標(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)線換(huan)算出相(xiang)應的濃度(du)。
