大鼠淋巴組織提取物實驗報告：

一、分離與培養：

1、無菌條(tiao)件下(xia)，取出(chu)1-3d 齡SD大(da)鼠(shu)心(xin)房組(zu)(zu)織，然(ran)后用(yong)PBS將此組(zu)(zu)織塊清洗(xi)2次，后將組(zu)(zu)織剪成1mm3左右大(da)小(xiao)；

2、往(wang)組織塊中加入4 mL酶(mei)消化(hua)液(ye)（0.1% 胰(yi)酶(mei)和0.1% I型膠原酶(mei)），混懸(xuan)10s，置37℃條(tiao)件(jian)下消化(hua)10min，之后用滴管吹打制成(cheng)單(dan)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)，自(zi)然沉淀并收(shou)集上清，用含10% FBS培養基終止(zhi)消化(hua)后4℃放置；

3、剩下的組織再(zai)加入3～4mL酶消(xiao)化(hua)液(ye)，混懸10s，置(zhi)(zhi)37℃消(xiao)化(hua)10 min后(hou)(hou)，按上(shang)述方法收集上(shang)清并終(zhong)止消(xiao)化(hua)后(hou)(hou)4℃放(fang)置(zhi)(zhi)，重(zhong)復(fu)此步驟2-3次，直至組織*被消(xiao)化(hua)；

4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化(hua)液(ye)，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培(pei)(pei)養(yang)基混(hun)懸(xuan)，接種于25cm2培(pei)(pei)養(yang)瓶(ping)，放置于37℃ ，5％CO2 培(pei)(pei)養(yang)箱中培(pei)(pei)養(yang)；

5、差(cha)速(su)貼壁1h后，吸(xi)出培養(yang)基，按實驗需要接種于(yu)6孔板中繼續培養(yang)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生(sheng)長(chang)至80%融合(he)時，棄去培養基，用溫育(yu)的PBS沖(chong)洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛(quan)在室溫條(tiao)件下(xia)固定細胞15min；

2、PBS沖(chong)洗(xi)細(xi)胞2次(ci)(ci)，每次(ci)(ci)10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透(tou)膜15min；

3、PBS沖(chong)洗細胞(bao)2次(ci)，每次(ci)10min，然(ran)后在室溫條件下，用(yong)4% BSA封閉細胞(bao)30min；

4、按1: 100的比(bi)例稀(xi)釋α-actin一(yi)抗，然后將其放在4℃冰箱中(zhong)孵育(yu)細胞過(guo)夜；

5、PBS沖(chong)洗細胞3次，每次10min，按(an)1：150的比(bi)例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，后在倒置(zhi)熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。