肥胖帶絳蟲PCR檢測試(shi)劑盒(he)說明(ming)書

使用方法(fa)：

測(ce)定法的(de)靈(ling)敏度來(lai)自作為報告的(de)酶(mei)。酶(mei)是(shi)一(yi)種有機(ji)催化劑，很少量的(de)酶(mei)即可(ke)(ke)誘(you)導大(da)量的(de)催化反應，產生(sheng)可(ke)(ke)供觀察的(de)顯色反應現象。因此該體(ti)系常被稱(cheng)為酶(mei)放大(da)體(ti)系。

1. 標準品(pin)(pin)的稀釋(shi)：本(ben)試劑盒提供(gong)原倍標準品(pin)(pin)一(yi)支，用(yong)戶可按照下列圖表在小試管中進行(xing)稀釋(shi)。   24μg/ml    5號(hao)標準品(pin)(pin)    150μl的原倍標準品(pin)(pin)加入150μl標準品(pin)(pin)稀釋(shi)液

12μg/ml    4號標準品    150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液

6μg/ml     3號(hao)標準品(pin)    150μl的4號(hao)標準品(pin)加入150μl標準品(pin)稀釋液(ye)

3μg/ml     2號標準品(pin)(pin)    150μl的3號標準品(pin)(pin)加入150μl標準品(pin)(pin)稀釋液

1.5μg/ml   1號(hao)標(biao)準(zhun)品    150μl的2號(hao)標(biao)準(zhun)品加入150μl標(biao)準(zhun)品稀(xi)釋液(ye)

2. 加(jia)(jia)樣(yang)(yang)：分別設空白孔(kong)(kong)、標準孔(kong)(kong)、待測樣(yang)(yang)品(pin)(pin)孔(kong)(kong)。在酶標包被板上標準品(pin)(pin)準確加(jia)(jia)樣(yang)(yang)50μl，待測樣(yang)(yang)品(pin)(pin)孔(kong)(kong)中(zhong)先加(jia)(jia)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)稀釋液40μl，然(ran)后再加(jia)(jia)待測樣(yang)(yang)品(pin)(pin)10μl（樣(yang)(yang)品(pin)(pin)終稀釋度為5倍）。加(jia)(jia)樣(yang)(yang)將(jiang)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)加(jia)(jia)于(yu)酶標板孔(kong)(kong)底(di)部(bu)，盡量不觸及孔(kong)(kong)壁(bi)，輕輕晃(huang)動(dong)混勻。|

3. 溫(wen)育(yu)：用(yong)封(feng)板(ban)(ban)膜封(feng)板(ban)(ban)后(hou)置37℃溫(wen)育(yu)30分鐘。   

4. 配(pei)液：將30倍濃縮洗(xi)滌液用蒸餾(liu)水30倍稀釋(shi)后備用

5. 洗滌：小心(xin)揭掉封板膜，棄去(qu)液(ye)體(ti)，甩(shuai)干(gan)，每孔加滿(man)洗滌液(ye)，靜置30秒后棄去(qu)，如此重復5次，拍干(gan)。

6. 加(jia)酶(mei)：每孔加(jia)入(ru)酶(mei)標試劑50μl，空白孔除外。

7. 溫育：操(cao)作同3。

8. 洗滌(di)：操作(zuo)同5。

9. 顯色(se)(se)：每孔先加入(ru)顯色(se)(se)劑(ji)A50μl，再加入(ru)顯色(se)(se)劑(ji)B50μl，輕輕震蕩混勻(yun)，37℃避光顯色(se)(se)15分鐘(zhong).

10. 終止(zhi)：每孔加(jia)終止(zhi)液50μl，終止(zhi)反應（此(ci)時藍色(se)立轉黃(huang)色(se)）。

11. 測(ce)定：以空白空調零，450nm波長依(yi)序(xu)測(ce)量各孔(kong)的吸光(guang)度（OD值）。 測(ce)定應在加(jia)終止(zhi)液后15分鐘以內進行(xing)。

實(shi)驗規則：

1、要保證移液槍的(de)準確性，誤(wu)差不能超(chao)過2%。可(ke)用(yong)水(shui)和電(dian)子(zi)天平進行(xing)確定(ding)。但有專業(ye)人員進行(xing)矯正。

2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各(ge)一支。吸(xi)取不(bu)同的液體后，要更(geng)換(huan)槍頭。即使是吸(xi)取標準品時。

3、要在實驗前1小時將試劑盒從冰箱中取出，使(shi)各種試劑都恢(hui)復到室溫(wen)，以使(shi)結果更穩定(ding)。

4、實驗時，要(yao)使底物避光保存。

5、用槍吸取液體時速(su)度(du)不(bu)能太快，以(yi)免(mian)產生氣泡而使吸取量(liang)不(bu)準確。

6、吸(xi)(xi)取液(ye)體時，要用量(liang)程(cheng)和需要量(liang)接近的(de)槍去吸(xi)(xi)，減少誤差。

7、將液(ye)體加到酶標孔中(zhong)時(shi)，避免槍(qiang)頭和孔內液(ye)體接觸，可(ke)使槍(qiang)頭上的(de)液(ye)滴和孔壁接觸，液(ye)滴會自然流(liu)下去(qu)。

8、液(ye)體全部加完(wan)后，可將酶標板在桌子上平行輕輕晃(huang)動30秒，混(hun)勻液(ye)體。也可以用酶標儀(yi)的晃(huang)動功能。

9、應盡量做雙孔實驗，這樣才能保證數據(ju)的準確性。

10、對結果有疑問的(de)樣品(pin)要(yao)用其它方(fang)法進行確證(zheng)。

實驗注意事(shi)項：

1）RT-PCR可以檢測組織(zhi)、細(xi)胞、血液(ye)、細(xi)菌等(deng)很多材料，不同的(de)樣(yang)本有不同要(yao)求，實驗前(qian)請充分溝(gou)通確認(ren)實驗方案和(he)樣(yang)本情況；

2）客戶盡可能提供實驗的(de)背景信息、物種(zhong)、基因準確的(de)名稱和ID號(hao)；

3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。

4）樣本保存于液氮(dan)或干(gan)冰，也可以保存于Trizol液中。

實(shi)(shi)時(shi)熒(ying)光(guang)定(ding)(ding)(ding)量(liang)(liang)PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指(zhi)(zhi)在(zai)PCR反應體系(xi)中(zhong)加(jia)入熒(ying)光(guang)基(ji)團，利(li)用熒(ying)光(guang)信(xin)號積累實(shi)(shi)時(shi)監測整個PCR進(jin)程(cheng)，*通過標準曲線對(dui)未知(zhi)模板進(jin)行(xing)定(ding)(ding)(ding)量(liang)(liang)分析的(de)方法。實(shi)(shi)時(shi)熒(ying)光(guang)定(ding)(ding)(ding)量(liang)(liang)PCR的(de)化學原理包(bao)括探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)類(lei)和非(fei)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)類(lei)兩(liang)類(lei)，探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)類(lei)是利(li)用與靶細胞序列特異性(xing)雜交(jiao)的(de)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)來(lai)指(zhi)(zhi)示擴增(zeng)(zeng)產(chan)物的(de)增(zeng)(zeng)加(jia)，非(fei)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)類(lei)是利(li)用熒(ying)光(guang)染料或者特異性(xing)設計的(de)引(yin)物來(lai)指(zhi)(zhi)示擴增(zeng)(zeng)的(de)增(zeng)(zeng)加(jia)。運用該技術可以對(dui)DNA、RNA樣品進(jin)行(xing)定(ding)(ding)(ding)量(liang)(liang)（包(bao)括*定(ding)(ding)(ding)量(liang)(liang)和相對(dui)定(ding)(ding)(ding)量(liang)(liang)）和定(ding)(ding)(ding)性(xing)分析。

主(zhu)要服務：DNA或(huo)RNA的*定量(liang)分析、基因(yin)表(biao)達差異分析、基因(yin)分型。

主要技術：引物(wu)設計(ji)、RNA提(ti)取、cDNA合成、qPCR。