牛(niu)膽(dan)酸（Cholic acid）elisa試劑盒說明書

elisa試劑(ji)盒(he)常見組(zu)成部分：

1）酶(mei)(mei)和底物(wu)：在ELISA中zui常用的酶(mei)(mei)為HRP和ALP。

2）抗(kang)(kang)體：在ELISA中應(ying)用的抗(kang)(kang)體可分為多克隆抗(kang)(kang)體(多抗(kang)(kang))和(he)單克隆抗(kang)(kang)體(單抗(kang)(kang))。

3）抗原(yuan)：在(zai)ELISA中(zhong)應用的抗原(yuan)要求有(you)較高的特(te)異性、親(qin)和力和純度。主要有(you)三(san)類，即自然抗原(yuan)、人(ren)工合成抗原(yuan)和基因重組(zu)抗原(yuan)。

4 人(ren)E選擇素(E-Selectin/CD62E)檢測(ce)試(shi)劑(ji)盒包(bao)(bao)被：將免疫活性物質(抗原或(huo)抗體)結合于固相載體上的(de)過程稱為包(bao)(bao)被。常用(yong)(yong)的(de)材料有(you)聚苯乙烯、硝(xiao)酸(suan)纖維(wei)薄膜等；常用(yong)(yong)的(de)方法(fa)有(you)吸(xi)附法(fa)、化(hua)學(xue)交聯(lian)法(fa)及親和素-生物素間接(jie)包(bao)(bao)被法(fa)

5）固(gu)(gu)相載體：固(gu)(gu)相載體是ELISA中用以分離結合(he)標記(ji)物(wu)和(he)游(you)離標記(ji)物(wu)的(de)主要手段，應與(yu)各種(zhong)免(mian)疫活性(xing)物(wu)質有良好的(de)結合(he)性(xing)能(neng)并且不改變其免(mian)疫活性(xing)。常用的(de)固(gu)(gu)相載體有聚苯乙烯塑料(liao)和(he)硝酸纖維素膜。

樣本實驗前準備：

ELISA試(shi)劑盒液(ye)體樣本：包括(kuo)血清、血漿、尿液(ye)、胸腹水、腦脊液(ye)、細胞培養上清等。

（1）血清

室溫血(xue)液自(zi)然凝固10-20分(fen)鐘(zhong)后，離心20分(fen)鐘(zhong)左右(you)（2000-3000轉/分(fen)）。仔(zi)細收集(ji)上清。保存過程(cheng)中如有沉淀形成，應再次離心。

（2）血漿：

應(ying)根據標本的要(yao)求選擇EDTA、檸(ning)檬酸(suan)鈉或肝(gan)素作為抗凝劑，混合10-20分(fen)(fen)鐘(zhong)后，離心20分(fen)(fen)鐘(zhong)左(zuo)右(you)（2000-3000轉/分(fen)(fen)）。仔細(xi)收集上(shang)清。保存(cun)過程中如(ru)有沉淀形成，應(ying)再次離心。

（3）尿液：

用無(wu)菌管收(shou)集(ji)(ji)。離心(xin)20分鐘左右(you)（2000-3000轉/分）。仔細收(shou)集(ji)(ji)上清。保存過程(cheng)中如有沉淀形成，應再次離心(xin)。胸(xiong)腹(fu)水、腦(nao)脊液參照此實行。

（4）細(xi)胞培養上清：

檢測分(fen)泌性的成份時(shi)，用無菌管收集(ji)。離心20分(fen)鐘左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔細收集(ji)上清。

（5）培養細胞

檢測細(xi)胞內的成份(fen)時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xi)胞懸液，細(xi)胞濃度達(da)到100萬/ml左右(you)。通(tong)過(guo)反(fan)復凍融或加入組(zu)織蛋白萃取(qu)試劑，以使細(xi)胞破壞并放(fang)出細(xi)胞內成份(fen)。離(li)心20分(fen)鐘左右(you)（2000-3000轉/分(fen)）。仔細(xi)收(shou)集(ji)上清。保存過(guo)程中(zhong)如有沉淀形成，應再次離(li)心。

（6）組織標本

切割(ge)標(biao)本(ben)后(hou)，稱取(qu)重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用(yong)液(ye)氮迅速冷(leng)凍(dong)保存(cun)備用(yong)。標(biao)本(ben)融(rong)化(hua)(hua)后(hou)仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），或(huo)組織(zhi)蛋白萃取(qu)試(shi)劑, 用(yong)手工或(huo)勻漿器將標(biao)本(ben)勻漿化(hua)(hua)。離心(xin)20分(fen)鐘左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔細收集上清。分(fen)裝后(hou)一份(fen)待檢測，其余冷(leng)凍(dong)備用(yong)。

操作步驟

1. 標(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)的稀釋(shi)(shi)與加(jia)(jia)樣：在(zai)酶標(biao)(biao)包(bao)被板上設標(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)孔(kong)(kong)10孔(kong)(kong)，在(zai)di一(yi)、第(di)(di)二孔(kong)(kong)中(zhong)(zhong)分(fen)(fen)別(bie)(bie)加(jia)(jia)標(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)100μl，然后(hou)在(zai)di一(yi)、第(di)(di)二孔(kong)(kong)中(zhong)(zhong)加(jia)(jia)標(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)稀釋(shi)(shi)液(ye)50μl，混(hun)(hun)勻(yun)；然后(hou)從(cong)di一(yi)孔(kong)(kong)、第(di)(di)二孔(kong)(kong)中(zhong)(zhong)各取(qu)(qu)(qu)100μl分(fen)(fen)別(bie)(bie)加(jia)(jia)到(dao)第(di)(di)三(san)孔(kong)(kong)和第(di)(di)四孔(kong)(kong)，再在(zai)第(di)(di)三(san)、第(di)(di)四孔(kong)(kong)分(fen)(fen)別(bie)(bie)加(jia)(jia)標(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)稀釋(shi)(shi)液(ye)50μl，混(hun)(hun)勻(yun)；然后(hou)在(zai)第(di)(di)三(san)孔(kong)(kong)和第(di)(di)四孔(kong)(kong)中(zhong)(zhong)先各取(qu)(qu)(qu)50μl棄掉(diao)(diao)，再各取(qu)(qu)(qu)50μl分(fen)(fen)別(bie)(bie)取(qu)(qu)(qu)50μl分(fen)(fen)別(bie)(bie)加(jia)(jia)到(dao)第(di)(di)七(qi)、第(di)(di)八(ba)孔(kong)(kong)中(zhong)(zhong)，再在(zai)第(di)(di)七(qi)、第(di)(di)八(ba)孔(kong)(kong)中(zhong)(zhong)分(fen)(fen)別(bie)(bie)加(jia)(jia)標(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)稀釋(shi)(shi)液(ye)50μl，混(hun)(hun)勻(yun)后(hou)從(cong)第(di)(di)七(qi)、第(di)(di)八(ba)孔(kong)(kong)中(zhong)(zhong)加(jia)(jia)到(dao)第(di)(di)五、第(di)(di)六孔(kong)(kong)中(zhong)(zhong)，再在(zai)第(di)(di)五、第(di)(di)六孔(kong)(kong)中(zhong)(zhong)分(fen)(fen)別(bie)(bie)加(jia)(jia)標(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)稀釋(shi)(shi)液(ye)50ul，混(hun)(hun)勻(yun)；混(hun)(hun)勻(yun)后(hou)從(cong)第(di)(di)五、第(di)(di)六孔(kong)(kong)中(zhong)(zhong)各分(fen)(fen)別(bie)(bie)取(qu)(qu)(qu)50μl加(jia)(jia)到(dao)第(di)(di)九(jiu)(jiu)、第(di)(di)十孔(kong)(kong)中(zhong)(zhong)，再在(zai)第(di)(di)九(jiu)(jiu)第(di)(di)十孔(kong)(kong)分(fen)(fen)別(bie)(bie)加(jia)(jia)標(biao)(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)稀釋(shi)(shi)液(ye)50μl，混(hun)(hun)勻(yun)后(hou)從(cong)第(di)(di)九(jiu)(jiu)第(di)(di)十孔(kong)(kong)中(zhong)(zhong)各取(qu)(qu)(qu)50μl棄掉(diao)(diao)。（稀釋(shi)(shi)后(hou)各孔(kong)(kong)加(jia)(jia)樣量都(dou)為50μl，濃度分(fen)(fen)別(bie)(bie)為180 ng/L，120 ng/L ，60 ng/L，30 ng/，15 ng/L）。

2. 加(jia)(jia)樣(yang)(yang)：分(fen)別(bie)設(she)空(kong)白孔(kong)（空(kong)白對照孔(kong)不加(jia)(jia)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)及(ji)酶標(biao)試劑，其余各(ge)步操作(zuo)相同(tong)）、待(dai)測樣(yang)(yang)品(pin)(pin)孔(kong)。在酶標(biao)包被(bei)板上待(dai)測樣(yang)(yang)品(pin)(pin)孔(kong)中先加(jia)(jia)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)稀釋液40μl，然后再加(jia)(jia)待(dai)測樣(yang)(yang)品(pin)(pin)10μl（樣(yang)(yang)品(pin)(pin)最終稀釋度為(wei)5倍(bei)）。加(jia)(jia)樣(yang)(yang)將樣(yang)(yang)品(pin)(pin)加(jia)(jia)于(yu)酶標(biao)板孔(kong)底部，盡量(liang)不觸及(ji)孔(kong)壁，輕(qing)輕(qing)晃動(dong)混(hun)勻。

3. 溫(wen)育(yu)：用封板(ban)膜封板(ban)后(hou)置37℃溫(wen)育(yu)30分(fen)鐘。

4. 配液(ye)：將30（48T的20倍(bei)(bei)(bei)）倍(bei)(bei)(bei)濃縮洗(xi)滌液(ye)用(yong)蒸餾水30（48T的20倍(bei)(bei)(bei)）倍(bei)(bei)(bei)稀釋后備用(yong)。

5. 洗(xi)滌：小心揭掉封板膜，棄去液(ye)體，甩(shuai)干，每孔(kong)加滿洗(xi)滌液(ye)，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6. 加酶：每孔(kong)加入酶標(biao)試劑50μl，空白(bai)孔(kong)除外(wai)。

7. 溫育(yu)：操作同3。

8. 洗滌：操(cao)作同5。

9. 顯(xian)色：每孔先加入顯(xian)色劑A50μl，再(zai)加入顯(xian)色劑B50μl，輕輕震(zhen)蕩混勻，37℃避光(guang)顯(xian)色15分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色(se)立轉黃色(se)）。

11. 測定(ding)：以空白空調零，450nm波長依(yi)序測量各孔(kong)的吸光度（OD值）。 測定(ding)應在加終(zhong)止液(ye)后15分鐘。

注意事項

1. 試劑(ji)盒從冷(leng)藏環境中(zhong)取出(chu)應(ying)在室溫平衡15-30 分鐘(zhong)后方可使用，酶標(biao)包被板開(kai)封后如未(wei)用完，板條應(ying)裝入密封袋中(zhong)保存。

2. 濃洗(xi)滌液可能(neng)會有(you)結晶(jing)析(xi)出，稀釋時可在(zai)水浴中(zhong)加溫助溶，洗(xi)滌時不影響結果。

3. 各(ge)步加(jia)(jia)樣(yang)均應使用加(jia)(jia)樣(yang)器，并經常校(xiao)對其準確性，以避免試(shi)驗(yan)誤差。一次加(jia)(jia)樣(yang)時間好控制(zhi)在5 分鐘內，如(ru)標本數量多，推薦使用排(pai)槍加(jia)(jia)樣(yang)。

4. 封(feng)板膜只限一次性使用，以(yi)避免交叉(cha)污染。

5. 底物(wu)請(qing)避光保存。

6. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以(yi)酶(mei)標儀讀(du)數為準(zhun).

7. 所有樣品，洗滌液和各種廢(fei)棄物都應按傳(chuan)染物處理。

8. 本(ben)試劑不同(tong)批(pi)號組分不得(de)混用(yong)。

9.如需(xu)代測或者樣本暫時不測定，可(ke)立(li)即低(di)溫(wen)凍存(cun)，溫(wen)度越低(di)越好(hao)，中間避免反復凍融(rong)，-20℃以下可(ke)保存(cun)三個(ge)月(yue)(yue),-70℃以下可(ke)保存(cun)六個(ge)月(yue)(yue)。

10.試劑使(shi)用須知：

11.（1）請參照(zhao)相關法規、文獻、MSDS等信息，理解(jie)并掌握好試(shi)劑的特(te)性，再進(jin)行安全操作。

12.（2）通常購買(mai)試劑時(shi)一定要(yao)想(xiang)到一次性用完。若(ruo)估算(suan)不足有剩余的話，更加注意其他(ta)保(bao)管和管理。

13.（3）萬(wan)一試(shi)劑操(cao)作(zuo)者(zhe)并非專業技術(shu)人員。必須在專業人士的指導(dao)監督(du)下進行操(cao)作(zuo)。對于使(shi)用(yong)后的廢棄物，不要或者(zhe)舊(jiu)的試(shi)劑，應按照相(xiang)關法律法規正(zheng)當處理。

14.（4）購買后，請務必確認(ren)(ren)標(biao)(biao)簽上的注(zhu)(zhu)意(yi)事項；做好(hao)(hao)預防顛倒(dao)，摔壞的措(cuo)施和(he)管理體(ti)制；在(zai)使用(yong)前再(zai)次確認(ren)(ren)標(biao)(biao)簽上的注(zhu)(zhu)意(yi)事項，做好(hao)(hao)必要的安全對策；對沒有標(biao)(biao)明其危害(hai)(hai)特性、有害(hai)(hai)特性的，也要慎重(zhong)地進行操作；必須(xu)帶(dai)好(hao)(hao)防護用(yong)具，小(xiao)心翼(yi)翼(yi)進行操作。