;       裸鼠克拉(la)拉(la)細胞蛋白（CC16）elisa試(shi)劑盒說明書

elisa試(shi)劑(ji)盒(he)常見(jian)組(zu)成部分：

1）酶(mei)和底(di)物：在ELISA中zui常用(yong)的酶(mei)為HRP和ALP。

2）抗體：在ELISA中應用的抗體可分為多(duo)(duo)克隆抗體(多(duo)(duo)抗)和單(dan)克隆抗體(單(dan)抗)。

3）抗原：在ELISA中應用的(de)抗原要求有較(jiao)高的(de)特異性(xing)、親和(he)(he)力(li)和(he)(he)純(chun)度。主要有三類，即自然(ran)抗原、人工合成抗原和(he)(he)基(ji)因重組抗原。

4 包(bao)(bao)被(bei)(bei)：將免疫活(huo)性(xing)物質(zhi)(抗(kang)原或抗(kang)體)結(jie)合(he)于固相載體上的過程稱為包(bao)(bao)被(bei)(bei)。常(chang)用(yong)的材(cai)料有(you)(you)聚苯乙烯、硝酸(suan)纖維(wei)薄膜等；常(chang)用(yong)的方(fang)法(fa)(fa)有(you)(you)吸附法(fa)(fa)、化學交聯法(fa)(fa)及親和素-生(sheng)物素間接包(bao)(bao)被(bei)(bei)法(fa)(fa)

5）固(gu)(gu)相(xiang)載(zai)(zai)體：固(gu)(gu)相(xiang)載(zai)(zai)體是ELISA中(zhong)用(yong)以分離(li)結(jie)合(he)標記(ji)物(wu)和游離(li)標記(ji)物(wu)的主要(yao)手段，應與各種免(mian)疫活性(xing)物(wu)質(zhi)有良好的結(jie)合(he)性(xing)能并且不改變其免(mian)疫活性(xing)。常用(yong)的固(gu)(gu)相(xiang)載(zai)(zai)體有聚苯乙烯塑料(liao)和硝酸纖維素膜(mo)。

樣本實驗前準備：

ELISA試劑盒(he)液(ye)體樣(yang)本(ben)：包(bao)括血清、血漿、尿液(ye)、胸腹(fu)水(shui)、腦(nao)脊液(ye)、細胞培養上(shang)清等。

（1）血清

室溫血液自然凝固10-20分鐘(zhong)后，離心20分鐘(zhong)左(zuo)右(you)（2000-3000轉(zhuan)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉(chen)淀形成，應再次離心。

（2）血漿：

應根(gen)據(ju)標本的要求選(xuan)擇EDTA、檸檬酸(suan)鈉或(huo)肝(gan)素作(zuo)為抗凝劑(ji)，混合10-20分鐘后，離(li)心20分鐘左右(you)（2000-3000轉/分）。仔(zi)細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離(li)心。

（3）尿液：

用無菌(jun)管收(shou)集。離(li)心(xin)20分(fen)鐘左右（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔細收(shou)集上清。保存過程(cheng)中如有(you)沉淀形成，應(ying)再次離(li)心(xin)。胸(xiong)腹水(shui)、腦脊(ji)液參照此(ci)實行。

（4）細胞培養上清：

檢測(ce)分(fen)泌性的成份時，用無菌管收(shou)集。離心20分(fen)鐘左右(you)（2000-3000轉/分(fen)）。仔細收(shou)集上清。

（5）培養細胞

檢測(ce)細(xi)胞內的成份時，用(yong)PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xi)胞懸(xuan)液，細(xi)胞濃度(du)達到100萬/ml左(zuo)右。通過反復凍融或加(jia)入(ru)組織蛋白萃(cui)取試劑，以使(shi)細(xi)胞破壞并(bing)放(fang)出細(xi)胞內成份。離心(xin)20分(fen)鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分(fen)）。仔細(xi)收集上清。保存過程(cheng)中如有(you)沉淀形成，應再次離心(xin)。

（6）組(zu)織標本

切割標(biao)本后，稱取重(zhong)量(liang)。加入(ru)一(yi)定量(liang)的(de)PBS，PH7.4。用液(ye)氮(dan)迅(xun)速冷(leng)凍(dong)保存備(bei)用。標(biao)本融化后仍然保持(chi)2-8℃的(de)溫度。加入(ru)一(yi)定量(liang)的(de)PBS（PH7.4），或組(zu)織蛋白(bai)萃取試劑, 用手(shou)工或勻漿(jiang)器將標(biao)本勻漿(jiang)化。離心20分鐘(zhong)左右（2000-3000轉(zhuan)/分）。仔(zi)細收(shou)集上清。分裝后一(yi)份待檢測，其余冷(leng)凍(dong)備(bei)用。

操作(zuo)步(bu)驟(zou)

1. 標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)的(de)稀釋(shi)與(yu)加(jia)(jia)樣：在(zai)酶標(biao)(biao)包被(bei)板上設標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)10孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)，在(zai)di一、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)二孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)分(fen)(fen)別(bie)加(jia)(jia)標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)100μl，然(ran)(ran)后(hou)在(zai)di一、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)二孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)加(jia)(jia)標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)稀釋(shi)液50μl，混(hun)勻(yun)；然(ran)(ran)后(hou)從(cong)di一孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)二孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)各(ge)(ge)取100μl分(fen)(fen)別(bie)加(jia)(jia)到(dao)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)三孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)和第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)四(si)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)，再(zai)(zai)在(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)三、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)四(si)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)分(fen)(fen)別(bie)加(jia)(jia)標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)稀釋(shi)液50μl，混(hun)勻(yun)；然(ran)(ran)后(hou)在(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)三孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)和第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)四(si)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)先各(ge)(ge)取50μl棄(qi)掉，再(zai)(zai)各(ge)(ge)取50μl分(fen)(fen)別(bie)取50μl分(fen)(fen)別(bie)加(jia)(jia)到(dao)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)七(qi)、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)八孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)，再(zai)(zai)在(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)七(qi)、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)八孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)分(fen)(fen)別(bie)加(jia)(jia)標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)稀釋(shi)液50μl，混(hun)勻(yun)后(hou)從(cong)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)七(qi)、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)八孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)加(jia)(jia)到(dao)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)五(wu)、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)六(liu)(liu)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)，再(zai)(zai)在(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)五(wu)、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)六(liu)(liu)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)分(fen)(fen)別(bie)加(jia)(jia)標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)稀釋(shi)液50ul，混(hun)勻(yun)；混(hun)勻(yun)后(hou)從(cong)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)五(wu)、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)六(liu)(liu)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)各(ge)(ge)分(fen)(fen)別(bie)取50μl加(jia)(jia)到(dao)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)九、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)十孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)，再(zai)(zai)在(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)九第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)十孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)分(fen)(fen)別(bie)加(jia)(jia)標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)稀釋(shi)液50μl，混(hun)勻(yun)后(hou)從(cong)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)九第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)十孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)各(ge)(ge)取50μl棄(qi)掉。（稀釋(shi)后(hou)各(ge)(ge)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)加(jia)(jia)樣量(liang)都(dou)為50μl，濃度(du)分(fen)(fen)別(bie)為180 ng/L，120 ng/L ，60 ng/L，30 ng/，15 ng/L）。

2. 加(jia)(jia)樣：分別設空(kong)(kong)白(bai)孔（空(kong)(kong)白(bai)對照孔不加(jia)(jia)樣品(pin)(pin)及酶標(biao)試劑，其余各步操作相同）、待測(ce)樣品(pin)(pin)孔。在酶標(biao)包(bao)被(bei)板(ban)上待測(ce)樣品(pin)(pin)孔中先加(jia)(jia)樣品(pin)(pin)稀釋液40μl，然(ran)后(hou)再加(jia)(jia)待測(ce)樣品(pin)(pin)10μl（樣品(pin)(pin)最(zui)終(zhong)稀釋度為5倍）。加(jia)(jia)樣將樣品(pin)(pin)加(jia)(jia)于酶標(biao)板(ban)孔底部，盡量不觸及孔壁(bi)，輕輕晃(huang)動混勻(yun)。

3. 溫(wen)育：用(yong)封板膜封板后置(zhi)37℃溫(wen)育30分(fen)鐘。

4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮(suo)洗(xi)滌液用蒸(zheng)餾水30（48T的20倍）倍稀釋(shi)后(hou)備用。

5. 洗滌：小心(xin)揭掉(diao)封板膜，棄去(qu)液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去(qu)，如此重復5次，拍干。

6. 加酶：每孔(kong)加入(ru)酶標試劑50μl，空白孔(kong)除外。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操(cao)作同5。

9. 顯色(se)：每孔先加(jia)入顯色(se)劑A50μl，再加(jia)入顯色(se)劑B50μl，輕輕震(zhen)蕩混勻，37℃避光顯色(se)15分(fen)鐘.

10. 終(zhong)(zhong)止(zhi)：每孔(kong)加(jia)終(zhong)(zhong)止(zhi)液50μl，終(zhong)(zhong)止(zhi)反應（此時(shi)藍色立轉黃色）。

11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量(liang)各(ge)孔的(de)吸光度（OD值(zhi)）。 測定應在加終(zhong)止液(ye)后15分鐘。

注意事項(xiang)

1. 試劑(ji)盒(he)從冷藏環境中(zhong)取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被(bei)板開(kai)封(feng)后如未用完，板條應裝入(ru)密封(feng)袋中(zhong)保存(cun)。

2. 濃洗滌液可能會(hui)有結晶析出，稀釋時(shi)可在(zai)水浴(yu)中加(jia)溫助(zhu)溶，洗滌時(shi)不影響結果。

3. 各步加樣(yang)均應使用加樣(yang)器，并經(jing)常(chang)校對其準確性，以避(bi)免試驗誤差(cha)。一次(ci)加樣(yang)時間好控制在5 分鐘內，如標本(ben)數量(liang)多，推薦使用排槍加樣(yang)。

4. 封(feng)板膜只限一次性使用(yong)，以(yi)避免交叉污染。

5. 底(di)物請避光保存。

6. 嚴格按照說(shuo)明書的(de)操作進(jin)行，試驗結果判定必須以(yi)酶標儀讀數為準.

7. 所有樣品(pin)，洗滌液和(he)各種(zhong)廢棄物都應按傳染(ran)物處理。

8. 本(ben)試劑不同批號(hao)組分不得混用。

9.如需代測(ce)或者樣本(ben)暫時不測(ce)定，可(ke)立即低(di)溫(wen)凍存，溫(wen)度越(yue)低(di)越(yue)好，中間避免反復凍融，-20℃以(yi)下可(ke)保存三個月,-70℃以(yi)下可(ke)保存六個月。

10.試(shi)劑使用須知：

11.（1）請參(can)照(zhao)相關法規、文(wen)獻、MSDS等信息，理解并掌握好試(shi)劑的特性，再進行安(an)全操作(zuo)。

12.（2）通常購買試劑時一(yi)定要想到一(yi)次性用(yong)完(wan)。若(ruo)估算不足有剩(sheng)余的話，更加注意其(qi)他保(bao)管和管理。

13.（3）萬一試(shi)劑(ji)操作者并非專業技(ji)術人(ren)員(yuan)。必須在專業人(ren)士(shi)的指導(dao)監督下進行操作。對于使用后的廢棄物，不要或者舊的試(shi)劑(ji)，應按(an)照相關法律法規正當(dang)處理(li)。

14.（4）購買后，請務必(bi)確認標簽上的注意(yi)事(shi)項；做(zuo)好預(yu)防顛倒，摔壞的措施和(he)管理體制；在使(shi)用前再次確認標簽上的注意(yi)事(shi)項，做(zuo)好必(bi)要的安(an)全對(dui)策(ce)；對(dui)沒有標明其危害特性、有害特性的，也要慎(shen)重地進行(xing)(xing)操作；必(bi)須帶好防護用具，小心翼(yi)翼(yi)進行(xing)(xing)操作。