牛金屬硫蛋白（MT）elisa試劑盒說明書

elisa試劑盒常見(jian)組(zu)成(cheng)部分(fen)：

1）酶和底物(wu)：在ELISA中(zhong)zui常用的酶為HRP和ALP。

2）抗(kang)體(ti)：在ELISA中應用的抗(kang)體(ti)可分為多(duo)(duo)克隆抗(kang)體(ti)(多(duo)(duo)抗(kang))和單克隆抗(kang)體(ti)(單抗(kang))。

3）抗原：在ELISA中應用(yong)的抗原要求有(you)較(jiao)高的特異(yi)性、親和力和純度。主要有(you)三類，即(ji)自然抗原、人工(gong)合成抗原和基因重(zhong)組抗原。

4 人E選擇素(E-Selectin/CD62E)檢測(ce)試(shi)劑盒包(bao)被(bei)：將免疫活性物質(抗原或抗體)結合于固相載體上的過程稱(cheng)為包(bao)被(bei)。常(chang)用的材料有聚苯乙烯、硝酸纖(xian)維薄膜等；常(chang)用的方法(fa)有吸附法(fa)、化學(xue)交聯(lian)法(fa)及親和素-生(sheng)物素間(jian)接包(bao)被(bei)法(fa)

5）固相載(zai)(zai)體(ti)：固相載(zai)(zai)體(ti)是ELISA中(zhong)用以(yi)分離結(jie)(jie)合標記(ji)物(wu)(wu)和游離標記(ji)物(wu)(wu)的(de)(de)主要手(shou)段(duan)，應與各種免疫(yi)活(huo)性物(wu)(wu)質有良好的(de)(de)結(jie)(jie)合性能并且不(bu)改變其免疫(yi)活(huo)性。常用的(de)(de)固相載(zai)(zai)體(ti)有聚(ju)苯乙烯塑料和硝酸纖維素膜(mo)。

樣本實驗前準備：

ELISA試劑(ji)盒液體樣本：包括(kuo)血清、血漿、尿液、胸腹(fu)水、腦脊液、細胞培養上清等(deng)。

（1）血清

室溫(wen)血液自(zi)然凝固10-20分鐘(zhong)后，離(li)心20分鐘(zhong)左右（2000-3000轉/分）。仔細(xi)收集上(shang)清(qing)。保存過程中如有沉淀形(xing)成，應再次離(li)心。

（2）血漿：

應根據標本的(de)要求選擇EDTA、檸檬酸鈉(na)或肝(gan)素作(zuo)為抗凝(ning)劑(ji)，混(hun)合10-20分鐘后，離(li)心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收(shou)集(ji)上清。保存過(guo)程中如(ru)有(you)沉淀形成，應再(zai)次離(li)心。

（3）尿液：

用(yong)無菌管(guan)收集(ji)。離(li)心20分鐘左右(you)（2000-3000轉/分）。仔細(xi)收集(ji)上清。保存過程中如(ru)有沉淀形(xing)成，應再次離(li)心。胸腹水、腦脊液參照此實(shi)行。

（4）細胞培養上(shang)清：

檢測分(fen)泌性(xing)的成(cheng)份時(shi)，用無菌管收集。離心20分(fen)鐘左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔細(xi)收集上清。

（5）培養細胞

檢測細胞(bao)內(nei)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞(bao)懸液(ye)，細胞(bao)濃度達到100萬/ml左(zuo)右(you)。通過反復凍(dong)融或加入組(zu)織蛋白萃取試劑，以使細胞(bao)破壞并放出細胞(bao)內(nei)成份。離心20分鐘左(zuo)右(you)（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有(you)沉淀形成，應再次離心。

（6）組織標本

切割(ge)標本(ben)后，稱取(qu)重量。加入(ru)一定量的(de)PBS，PH7.4。用液氮迅速冷(leng)凍(dong)保存備用。標本(ben)融化后仍(reng)然保持2-8℃的(de)溫(wen)度。加入(ru)一定量的(de)PBS（PH7.4），或組織蛋(dan)白萃取(qu)試劑, 用手(shou)工(gong)或勻(yun)漿器將標本(ben)勻(yun)漿化。離(li)心20分鐘(zhong)左右(you)（2000-3000轉/分）。仔(zi)細收集上清。分裝(zhuang)后一份(fen)待檢測，其余冷(leng)凍(dong)備用。

操作步驟

1. 標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)的(de)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)與加(jia)樣：在(zai)酶(mei)標(biao)包被板(ban)上設標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)孔(kong)(kong)(kong)(kong)10孔(kong)(kong)(kong)(kong)，在(zai)di一、第(di)(di)(di)(di)(di)二(er)孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)分(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)加(jia)標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)100μl，然后在(zai)di一、第(di)(di)(di)(di)(di)二(er)孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)加(jia)標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)(ye)50μl，混(hun)(hun)(hun)勻；然后從(cong)di一孔(kong)(kong)(kong)(kong)、第(di)(di)(di)(di)(di)二(er)孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)各(ge)(ge)取(qu)(qu)100μl分(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)加(jia)到第(di)(di)(di)(di)(di)三(san)孔(kong)(kong)(kong)(kong)和(he)第(di)(di)(di)(di)(di)四孔(kong)(kong)(kong)(kong)，再在(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)三(san)、第(di)(di)(di)(di)(di)四孔(kong)(kong)(kong)(kong)分(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)加(jia)標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)(ye)50μl，混(hun)(hun)(hun)勻；然后在(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)三(san)孔(kong)(kong)(kong)(kong)和(he)第(di)(di)(di)(di)(di)四孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)先各(ge)(ge)取(qu)(qu)50μl棄(qi)掉，再各(ge)(ge)取(qu)(qu)50μl分(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)取(qu)(qu)50μl分(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)加(jia)到第(di)(di)(di)(di)(di)七、第(di)(di)(di)(di)(di)八孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)，再在(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)七、第(di)(di)(di)(di)(di)八孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)分(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)加(jia)標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)(ye)50μl，混(hun)(hun)(hun)勻后從(cong)第(di)(di)(di)(di)(di)七、第(di)(di)(di)(di)(di)八孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)加(jia)到第(di)(di)(di)(di)(di)五(wu)、第(di)(di)(di)(di)(di)六孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)，再在(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)五(wu)、第(di)(di)(di)(di)(di)六孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)分(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)加(jia)標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)(ye)50ul，混(hun)(hun)(hun)勻；混(hun)(hun)(hun)勻后從(cong)第(di)(di)(di)(di)(di)五(wu)、第(di)(di)(di)(di)(di)六孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)各(ge)(ge)分(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)取(qu)(qu)50μl加(jia)到第(di)(di)(di)(di)(di)九(jiu)(jiu)、第(di)(di)(di)(di)(di)十孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)，再在(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)九(jiu)(jiu)第(di)(di)(di)(di)(di)十孔(kong)(kong)(kong)(kong)分(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)加(jia)標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)液(ye)(ye)50μl，混(hun)(hun)(hun)勻后從(cong)第(di)(di)(di)(di)(di)九(jiu)(jiu)第(di)(di)(di)(di)(di)十孔(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)各(ge)(ge)取(qu)(qu)50μl棄(qi)掉。（稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)后各(ge)(ge)孔(kong)(kong)(kong)(kong)加(jia)樣量都(dou)為50μl，濃(nong)度分(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)為180 ng/L，120 ng/L ，60 ng/L，30 ng/，15 ng/L）。

2. 加(jia)(jia)樣(yang)(yang)(yang)：分別設空白孔(kong)（空白對照孔(kong)不加(jia)(jia)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)及(ji)酶(mei)標試劑，其(qi)余各步(bu)操(cao)作相(xiang)同）、待(dai)測樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)孔(kong)。在(zai)酶(mei)標包被板上(shang)待(dai)測樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)孔(kong)中先加(jia)(jia)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)稀釋液40μl，然后再加(jia)(jia)待(dai)測樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)10μl（樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)最終稀釋度(du)為(wei)5倍）。加(jia)(jia)樣(yang)(yang)(yang)將樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)加(jia)(jia)于酶(mei)標板孔(kong)底部，盡量不觸及(ji)孔(kong)壁(bi)，輕(qing)輕(qing)晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜(mo)封板后置37℃溫育30分鐘。

4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃(nong)縮洗(xi)滌液用蒸餾(liu)水30（48T的20倍）倍稀(xi)釋(shi)后備(bei)用。

5. 洗(xi)滌：小心揭掉(diao)封(feng)板膜，棄去(qu)液體，甩干，每孔(kong)加(jia)滿洗(xi)滌液，靜置30秒后棄去(qu)，如此(ci)重復5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外(wai)。

7. 溫(wen)育：操作同3。

8. 洗滌：操作同5。

9. 顯(xian)(xian)色：每(mei)孔先加入顯(xian)(xian)色劑A50μl，再(zai)加入顯(xian)(xian)色劑B50μl，輕輕震(zhen)蕩混勻(yun)，37℃避光顯(xian)(xian)色15分(fen)鐘(zhong).

10. 終(zhong)止：每(mei)孔加終(zhong)止液50μl，終(zhong)止反應（此時藍色立(li)轉黃色）。

11. 測(ce)定：以空白空調零(ling)，450nm波長(chang)依(yi)序(xu)測(ce)量各孔(kong)的吸光度（OD值）。 測(ce)定應在(zai)加終(zhong)止液(ye)后15分(fen)鐘。

注意事項

1. 試劑(ji)盒從(cong)冷藏(zang)環境中取出應在(zai)室(shi)溫平衡15-30 分(fen)鐘后(hou)方可(ke)使(shi)用(yong)，酶標包被板開封(feng)后(hou)如未用(yong)完，板條應裝入密封(feng)袋中保存(cun)。

2. 濃洗滌(di)液可能會(hui)有結晶(jing)析出，稀(xi)釋時可在水浴中加溫助(zhu)溶，洗滌(di)時不影響結果。

3. 各(ge)步加(jia)樣(yang)(yang)均應使(shi)(shi)用(yong)加(jia)樣(yang)(yang)器(qi)，并經常校(xiao)對其準確性，以避免(mian)試驗誤差(cha)。一(yi)次加(jia)樣(yang)(yang)時(shi)間(jian)好控制在(zai)5 分(fen)鐘內，如標本數量多(duo)，推薦使(shi)(shi)用(yong)排槍加(jia)樣(yang)(yang)。

4. 封板膜(mo)只限一次性(xing)使用，以避免交(jiao)叉污染。

5. 底物請避光保存。

6. 嚴格(ge)按照說明書的操作進行，試驗結果(guo)判定必須以酶標儀讀(du)數為準.

7. 所有樣(yang)品，洗滌液和(he)各種廢棄(qi)物(wu)都應(ying)按傳染物(wu)處理(li)。

8. 本試劑不同(tong)批號(hao)組(zu)分不得混用。

9.如需代測或者樣本暫時不(bu)測定，可(ke)立即(ji)低溫(wen)凍(dong)存(cun)，溫(wen)度越低越好，中(zhong)間避免(mian)反復凍(dong)融，-20℃以(yi)下可(ke)保存(cun)三個(ge)月,-70℃以(yi)下可(ke)保存(cun)六個(ge)月。

10.試劑使用(yong)須知：

11.（1）請參照相關法規、文獻、MSDS等信息，理解并(bing)掌握好試(shi)劑(ji)的特性，再進行安全操(cao)作(zuo)。

12.（2）通常購買試劑時一定要想到一次性用完。若估算不足有(you)剩余的話，更加注(zhu)意其他(ta)保(bao)管和管理。

13.（3）萬一試(shi)劑(ji)操(cao)(cao)作者并非(fei)專(zhuan)業技術人員。必須在專(zhuan)業人士的(de)指導監督下進行操(cao)(cao)作。對于使用后的(de)廢棄(qi)物(wu)，不(bu)要(yao)或(huo)者舊(jiu)的(de)試(shi)劑(ji)，應按照相關法律法規正當處理。

14.（4）購買(mai)后(hou)，請務必確認標簽(qian)上的注意事項；做好(hao)預防(fang)顛倒，摔壞(huai)的措施和管理體制；在使用(yong)前再次(ci)確認標簽(qian)上的注意事項，做好(hao)必要的安全(quan)對(dui)策；對(dui)沒有標明(ming)其(qi)危害特性、有害特性的，也要慎(shen)重地進行操(cao)作；必須帶好(hao)防(fang)護用(yong)具，小心翼翼進行操(cao)作。