牛葡萄糖6磷酸脫氫酶（G6PD）elisa試劑盒說明書

elisa試(shi)劑盒常見組成部分(fen)：

1）酶和底物：在ELISA中zui常用的酶為HRP和ALP。

2）抗體(ti)：在ELISA中應用(yong)的抗體(ti)可(ke)分為多(duo)克隆抗體(ti)(多(duo)抗)和單克隆抗體(ti)(單抗)。

3）抗(kang)原(yuan)(yuan)：在ELISA中應用的(de)(de)抗(kang)原(yuan)(yuan)要求有較(jiao)高的(de)(de)特異性(xing)、親和力和純度。主要有三類，即自然抗(kang)原(yuan)(yuan)、人工合成(cheng)抗(kang)原(yuan)(yuan)和基因重(zhong)組抗(kang)原(yuan)(yuan)。

4 人(ren)E選(xuan)擇素(E-Selectin/CD62E)檢(jian)測試劑盒(he)包被：將免疫活性物(wu)質(抗原或抗體(ti))結合于固相(xiang)載體(ti)上的過程稱為包被。常(chang)用(yong)的材料(liao)有聚(ju)苯(ben)乙(yi)烯、硝酸纖(xian)維薄膜(mo)等；常(chang)用(yong)的方法有吸(xi)附法、化學交聯法及親和素-生物(wu)素間接包被法

5）固相(xiang)載體(ti)：固相(xiang)載體(ti)是ELISA中用以分(fen)離結合標記(ji)物和游離標記(ji)物的主要手段，應與各種免(mian)疫活性(xing)物質有良好的結合性(xing)能并且不改變其免(mian)疫活性(xing)。常用的固相(xiang)載體(ti)有聚苯乙烯塑(su)料(liao)和硝酸纖維素膜。

樣本實驗前準備：

ELISA試劑(ji)盒液(ye)體樣(yang)本：包括血清、血漿、尿液(ye)、胸腹水、腦(nao)脊液(ye)、細胞培(pei)養上清等。

（1）血清

室溫血液自(zi)然凝固10-20分(fen)(fen)鐘后，離心20分(fen)(fen)鐘左右（2000-3000轉/分(fen)(fen)）。仔細收集上清(qing)。保存過程中如有沉淀形成(cheng)，應(ying)再次(ci)離心。

（2）血漿：

應(ying)根(gen)據標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或(huo)肝素作(zuo)為抗凝劑，混(hun)合10-20分(fen)鐘后，離心(xin)20分(fen)鐘左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔細收集上清。保(bao)存(cun)過程中(zhong)如有(you)沉淀(dian)形(xing)成，應(ying)再(zai)次離心(xin)。

（3）尿液：

用(yong)無菌管收集(ji)。離心20分(fen)(fen)鐘左右（2000-3000轉/分(fen)(fen)）。仔(zi)細(xi)收集(ji)上(shang)清。保存(cun)過程中如有沉淀(dian)形成(cheng)，應再次(ci)離心。胸腹水、腦脊(ji)液參照(zhao)此實(shi)行。

（4）細胞培養上清：

檢測分(fen)泌性的(de)成份時(shi)，用無(wu)菌管收(shou)集(ji)。離心20分(fen)鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分(fen)）。仔(zi)細收(shou)集(ji)上清(qing)。

（5）培養細胞

檢(jian)測細(xi)(xi)(xi)胞(bao)內的成(cheng)(cheng)份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xi)(xi)(xi)胞(bao)懸液，細(xi)(xi)(xi)胞(bao)濃度(du)達到100萬/ml左右。通過反復凍融(rong)或加入組(zu)織蛋白萃取試(shi)劑，以使細(xi)(xi)(xi)胞(bao)破壞(huai)并放(fang)出(chu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)內成(cheng)(cheng)份。離(li)心20分鐘(zhong)左右（2000-3000轉/分）。仔細(xi)(xi)(xi)收(shou)集上清。保存過程中(zhong)如(ru)有沉淀形成(cheng)(cheng)，應再次離(li)心。

（6）組織標本

切割標(biao)本后(hou)，稱取重量。加入(ru)一(yi)定(ding)量的PBS，PH7.4。用(yong)液(ye)氮迅速(su)冷凍保(bao)存備用(yong)。標(biao)本融化(hua)后(hou)仍(reng)然保(bao)持2-8℃的溫(wen)度。加入(ru)一(yi)定(ding)量的PBS（PH7.4），或組織蛋白(bai)萃(cui)取試劑, 用(yong)手工或勻(yun)漿器將(jiang)標(biao)本勻(yun)漿化(hua)。離心20分(fen)(fen)鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分(fen)(fen)）。仔(zi)細收集上清。分(fen)(fen)裝后(hou)一(yi)份待(dai)檢測，其余冷凍備用(yong)。

操作步驟

1. 標準(zhun)(zhun)品(pin)(pin)的(de)稀(xi)(xi)釋(shi)與加(jia)樣：在(zai)(zai)酶標包(bao)被板上設(she)標準(zhun)(zhun)品(pin)(pin)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)10孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)，在(zai)(zai)di一、第(di)(di)二(er)(er)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)分別(bie)(bie)加(jia)標準(zhun)(zhun)品(pin)(pin)100μl，然后(hou)在(zai)(zai)di一、第(di)(di)二(er)(er)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)加(jia)標準(zhun)(zhun)品(pin)(pin)稀(xi)(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混(hun)(hun)勻；然后(hou)從di一孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)、第(di)(di)二(er)(er)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)各(ge)(ge)取100μl分別(bie)(bie)加(jia)到(dao)第(di)(di)三(san)(san)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)和(he)(he)第(di)(di)四(si)(si)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)，再(zai)在(zai)(zai)第(di)(di)三(san)(san)、第(di)(di)四(si)(si)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)分別(bie)(bie)加(jia)標準(zhun)(zhun)品(pin)(pin)稀(xi)(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混(hun)(hun)勻；然后(hou)在(zai)(zai)第(di)(di)三(san)(san)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)和(he)(he)第(di)(di)四(si)(si)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)先(xian)各(ge)(ge)取50μl棄(qi)掉，再(zai)各(ge)(ge)取50μl分別(bie)(bie)取50μl分別(bie)(bie)加(jia)到(dao)第(di)(di)七、第(di)(di)八孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)，再(zai)在(zai)(zai)第(di)(di)七、第(di)(di)八孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)分別(bie)(bie)加(jia)標準(zhun)(zhun)品(pin)(pin)稀(xi)(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混(hun)(hun)勻后(hou)從第(di)(di)七、第(di)(di)八孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)加(jia)到(dao)第(di)(di)五(wu)(wu)、第(di)(di)六孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)，再(zai)在(zai)(zai)第(di)(di)五(wu)(wu)、第(di)(di)六孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)分別(bie)(bie)加(jia)標準(zhun)(zhun)品(pin)(pin)稀(xi)(xi)釋(shi)液(ye)50ul，混(hun)(hun)勻；混(hun)(hun)勻后(hou)從第(di)(di)五(wu)(wu)、第(di)(di)六孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)各(ge)(ge)分別(bie)(bie)取50μl加(jia)到(dao)第(di)(di)九、第(di)(di)十(shi)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)，再(zai)在(zai)(zai)第(di)(di)九第(di)(di)十(shi)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)分別(bie)(bie)加(jia)標準(zhun)(zhun)品(pin)(pin)稀(xi)(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混(hun)(hun)勻后(hou)從第(di)(di)九第(di)(di)十(shi)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)各(ge)(ge)取50μl棄(qi)掉。（稀(xi)(xi)釋(shi)后(hou)各(ge)(ge)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)加(jia)樣量都(dou)為(wei)50μl，濃度分別(bie)(bie)為(wei)180 ng/L，120 ng/L ，60 ng/L，30 ng/，15 ng/L）。

2. 加(jia)(jia)(jia)樣(yang)(yang)(yang)：分別設空白(bai)孔(kong)（空白(bai)對(dui)照孔(kong)不加(jia)(jia)(jia)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)及酶標試劑，其余各(ge)步(bu)操作相同）、待(dai)測(ce)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)孔(kong)。在(zai)酶標包被板上待(dai)測(ce)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)孔(kong)中先加(jia)(jia)(jia)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)稀(xi)釋液40μl，然(ran)后再(zai)加(jia)(jia)(jia)待(dai)測(ce)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)10μl（樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)最終稀(xi)釋度為5倍）。加(jia)(jia)(jia)樣(yang)(yang)(yang)將樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)加(jia)(jia)(jia)于酶標板孔(kong)底部，盡量不觸(chu)及孔(kong)壁(bi)，輕輕晃動混勻(yun)。

3. 溫育：用封(feng)板膜封(feng)板后置37℃溫育30分鐘(zhong)。

4. 配液：將30（48T的20倍(bei)）倍(bei)濃縮(suo)洗(xi)滌液用蒸(zheng)餾(liu)水30（48T的20倍(bei)）倍(bei)稀釋后備用。

5. 洗滌(di)：小心揭掉(diao)封板(ban)膜，棄(qi)去液體，甩干，每孔加滿洗滌(di)液，靜置30秒后棄(qi)去，如(ru)此(ci)重復5次，拍干。

6. 加(jia)酶：每孔(kong)加(jia)入酶標(biao)試劑(ji)50μl，空白孔(kong)除(chu)外。

7. 溫育(yu)：操作同3。

8. 洗滌：操作同5。

9. 顯(xian)(xian)色(se)：每孔先(xian)加入顯(xian)(xian)色(se)劑(ji)A50μl，再加入顯(xian)(xian)色(se)劑(ji)B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯(xian)(xian)色(se)15分鐘(zhong).

10. 終(zhong)止(zhi)：每孔(kong)加(jia)終(zhong)止(zhi)液(ye)50μl，終(zhong)止(zhi)反應（此時藍色立轉黃色）。

11. 測定：以空(kong)白空(kong)調零，450nm波長依序測量(liang)各孔的吸(xi)光度（OD值(zhi)）。 測定應在(zai)加(jia)終(zhong)止(zhi)液后15分(fen)鐘。

注意事項

1. 試(shi)劑盒從冷藏(zang)環(huan)境(jing)中取出應在室溫平衡(heng)15-30 分鐘后方可使(shi)用(yong)，酶標包被板開封后如未(wei)用(yong)完，板條應裝入(ru)密(mi)封袋中保存(cun)。

2. 濃洗滌液(ye)可(ke)能會有結(jie)(jie)晶析出，稀釋時可(ke)在水(shui)浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jie)(jie)果。

3. 各(ge)步(bu)加樣(yang)均(jun)應(ying)使用加樣(yang)器，并經常(chang)校對其準確性，以(yi)避免試驗(yan)誤(wu)差(cha)。一(yi)次加樣(yang)時間好控制在5 分(fen)鐘內，如(ru)標本數量多(duo)，推(tui)薦使用排(pai)槍加樣(yang)。

4. 封板膜只限一(yi)次性使用，以避(bi)免交叉污染。

5. 底物請避光保存。

6. 嚴格按照(zhao)說明書的操作進行，試驗(yan)結果判定必須(xu)以酶標(biao)儀讀(du)數(shu)為(wei)準.

7. 所有樣品，洗滌液和各種(zhong)廢(fei)棄物都應按傳染(ran)物處理。

8. 本試劑不(bu)同批號組分不(bu)得混(hun)用。

9.如需代測或者樣本暫時不(bu)測定，可(ke)立(li)即低(di)溫凍存(cun)，溫度越(yue)低(di)越(yue)好，中間避免反復(fu)凍融(rong)，-20℃以下可(ke)保存(cun)三(san)個月,-70℃以下可(ke)保存(cun)六個月。

10.試(shi)劑使用(yong)須知：

11.（1）請參照相關法規、文(wen)獻(xian)、MSDS等信(xin)息(xi)，理解并(bing)掌握好試劑的特(te)性，再進(jin)行(xing)安全(quan)操作(zuo)。

12.（2）通(tong)常購(gou)買試劑時一(yi)定要想到一(yi)次(ci)性(xing)用完。若估算(suan)不足(zu)有剩余的話(hua)，更加注意(yi)其他保管和管理。

13.（3）萬一試(shi)劑(ji)操作(zuo)者并非專業(ye)技術(shu)人員。必(bi)須在專業(ye)人士的指(zhi)導監督下進行(xing)操作(zuo)。對于(yu)使用后(hou)的廢棄物，不要或者舊的試(shi)劑(ji)，應(ying)按照相關法律法規(gui)正(zheng)當處理(li)。

14.（4）購買后，請務必(bi)確(que)認標(biao)簽(qian)上(shang)的(de)注意事項；做好預防(fang)顛倒，摔壞(huai)的(de)措(cuo)施(shi)和管理體制(zhi)；在使用(yong)前再次確(que)認標(biao)簽(qian)上(shang)的(de)注意事項，做好必(bi)要的(de)安全對策(ce)；對沒有(you)標(biao)明其危害特性、有(you)害特性的(de)，也要慎重地進行(xing)操作；必(bi)須帶好防(fang)護用(yong)具，小心翼(yi)翼(yi)進行(xing)操作。